Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2019; 53(1): 1-11

MALDI-TOF MS'nin EMB Agarda �reyen Gram-negatif Bakterileri Tanımlama Performansı:
Tanı Etkinliğini Arttıran Basit Bir Y�ntem

Performance of MALDI-TOF MS for the Identification of Gram-negative Bacteria Grown on
Eosin Methylene Blue (EMB) Agar: A Simple Method for Improving the Effectiveness of Identification

Yusuf YAKUPOĞULLARI1, Barış OTLU1, Bet�l �ELİK1, Harika G�zde G�Z�KARA BAĞ2

1 İn�n� �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Malatya.

1 İn�n� University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Malatya, Turkey.

2 İn�n� �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Biyoistatistik ve Tıp Bilişimi Anabilim Dalı, Malatya.

2 İn�n� University Faculty of Medicine, Department of Biostatistics and Medical Informationt, Malatya, Turkey.

Makale Atıfı: Yakupoğulları Y, Otlu B, �elik B, G�z�kara Bağ HG. MALDI-TOF MS'nin EMB Agarda �reyen Gram-negatif Bakterileri Tanımlama Performansı: Tanı Etkinliğini Arttıran Basit Bir Y�ntem. Mikrobiyol Bul 2019;53(1):1-11

�Z

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS), bakteriyel ve fungal patojenleri doğru ve hızlı tanımlaması nedeniyle mikrobiyoloji laboratuvarlarında kullanımı artan yeni bir y�ntemdir. Ancak, bu y�ntemle yapılacak tanımlamalarda g�n�m�ze kadar tek bir gram-negatif se�ici besiyerinin �nerilmiş olması rutin klinik tanıda bazı sorunlara neden olmaktadır. EMB agar, yaygın olarak kullanılan geleneksel bir gram-negatif se�ici besiyeri olmakla birlikte MALDI TOF MS'nin bu besiyerinde �reyen gram-negatif bakterileri tanımlama etkinliği hakkında bilimsel literat�rde bilgi yoktur. Bu �alışmada, MALDI-TOF MS'nin EMB agarda �reyen gram-negatif bakterileri tanımlama performansının saptanması ve bu performansı arttırıcı basit ve hızlı bir �rnek hazırlama y�nteminin geliştirilmesi ama�lanmıştır. Toplam 20 farklı cins ve 37 farklı t�rden olmak �zere 468 gram-negatif klinik izolat �alışmaya alınmıştır. İzolatların EMB agarda �reyen kolonileri hem direkt ve hem de iki aşamalı koloni yıkama işlemi (bir kez serum fizyolojik, �� kez %70 etanol ile yıkama) sonrasında Vitek MS (Bio M�rieux, Fransa) MALDI-TOF MS cihazı ile tanımlanmıştır. Her iki tanımlamaya ait veriler istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır. EMB agar besiyerinden direkt okumada, �alışılan 468 izolatın 382'si (%81.6) t�r d�zeyinde doğru olarak tanımlanmıştır, 80 (%17) izolat tanımlanamamış ve 6 (%1.2) izolat (d�rd� cins d�zeyinde) ise yanlış tanımlanmıştır. Direkt okumada MALDI-TOF MS'in tanı performansı Stenotrophomonas maltophilia, Klebsiella oxytoca, Salmonella spp. ve Proteus mirabilis'in de i�inde bulunduğu 14 t�r i�in m�kemmel (%100) iken, en d�ş�k tanı performansı Providencia spp. (%62.5), Escherichia coli (%70.5) ve Acinetobacter spp. (%70.7) i�in saptanmıştır. Ortalama 20 dakika s�ren ve basit laboratuvar malzemeleri ile ger�ekleştirilebilen yıkama işlemi sonrası, 434 (%92.7) izolat t�r d�zeyinde doğru olarak tanımlanmıştır, 30 (%6.4) izolat tanımlanmamıştır ve 4 (%0.85) izolat (ikisi cins d�zeyinde) ise yanlış tanımlanmıştır. İstatistiksel veri analizi, tanımladığımız koloni yıkama işleminin besiyerinden yoğun boya absorbe eden E.coli ve A.baumannii gibi t�rler başta olmak �zere EMB agarda �reyen gram-negatif bakterilerin MALDI-TOF MS ile tanımlama oranını toplamda anlamlı d�zeyde arttırdığını g�stermiştir (p= 0.001). Bu �alışmada, k�tle spektrometrik tanımlamaya uygunluğu hakkında bu g�ne kadar veri bulunmayan EMB agarın, MALDI-TOF MS ile yapılacak bakteriyel tanımlamada kullanılabileceği ve EMB besiyerinden direkt okumada tanımlanamayan gram-negatif bakterilerin burada a�ıkladığımız koloni yıkama işlemi sonrasında tanımlanabilecekleri ortaya konulmuştur. Farklı besiyeri alternatiflerinin belirlenmesi, MALDI-TOF MS'nin mikrobiyoloji laboratuvarlarında daha etkin kullanımına katkı sağlayacaktır.

Anahtar kelimeler: EMB agar; MALDI-TOF MS; Gram-negatif bakteri.

ABSTRACT

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) is a new method that is increasingly used in microbiology laboratories due to its ability of reliable and rapid identification (ID) of bacteria and fungi. However, some problems emerge in the routine clinical diagnosis since only one gram-negative selective medium has been suggested up to date. Though EMB agar is one of the traditional gram-negative selective media, there is no data in the scientific literature, about the ID performance of MALDI TOF MS with the gram-negative bacteria grown on this medium. In this study, we tested the ID performance of MALDI-TOF MS for gram-negative isolates on EMB agar and aimed to develop a rapid and easy sample preparation method for improving this performance. A total of 468 clinical isolates of gram-negative bacteria, consisting of 37 different species from 20 genera, were included in this study. The isolates were identified using the Vitek MS MALDI-TOF MS (Bio M�rieux, France) both directly from EMB agar, and also through a two-step colony washing (once with physiologic saline, and three times with 70% ethanol) method. The performances of these two IDs were compared. In the direct reading from EMB medium, 382 (81.6%) of 468 studied isolates were correctly identified at species level; no ID was detected for 80 (17%) isolates, and 6 (1.2%) isolates (four at the genus level) were misidentified Performance of MALDI-TOF MS directly from EMB agar was excellent (100%) for 14 species including Stenotrophomonas maltophilia, Klebsiella oxytoca, Salmonella spp., and Proteus mirabilis; and lowest for Providencia spp. (62.5%), Escherichia coli (70.5%) and Acinetobacter spp. (70.7%). Following the washing procedure which was performed about 20 min with simple laboratory equipment, 434 (92.7%) isolates were correctly identified at species level; 30 (6.4%) strains could not be identified, and four (0.85%) isolates (two at the genus level) were misidentified. Statistical analyses indicated that the washing procedure defined here significantly increased the overall ID performance of MALDI-TOF MS with EMB agar (p= 0.001), particularly with improving the IDs of those markedly dye-absorbing genera, such as E.coli and A.baumannii. In this study, EMB agar which has no data until today on its suitability for mass spectrometric identification has been shown to be useful for bacterial identification with MALDI-TOF MS. In addition, the unidentified gram-negative bacteria in the direct reading from the EMB medium have been shown to be identified after the colony washing method as described here. Determination of the different medium alternatives will contribute to effective usage of MALDI-TOF MS in microbiology laboratories.

Keywords: EMB agar; MALDI-TOF MS; Gram-negative bacteria.

Geliş Tarihi (Received): 19.07.2018 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 17.10.2018

GİRİŞ

Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI- TOF MS), 2009 yılından beri rutin klinik tanıya girmiş yeni bir mikroorganizma tanımlama y�ntemidir. Bu y�ntemde, bakteri veya mantarların ribozomal proteinleri matriks ile iyonize edilerek u�urulmakta, proteinlerin u�uş zamanına g�re molek�ler k�tleleri hesaplanmakta ve test edilen mikroorganizmanın protein spektrumu elde edilerek tanımlanmaktadır. B�ylelikle, g�n�m�zde 1000'den fazla klinik olarak �nemli bakteri ve mantar t�r�n�n adlandırılması, IVD ve CE sertifikalı olarak dakikalar i�inde ger�ekleştirilmektedir1. Yapılan �alışmalarda, bu y�ntemin performansı hakkında tatmin edici sonu�lar bildirilmiş olup MALDI-TOF MS'nin gram-pozitif, gram-negatif, aerobik ve anaerobik bakteri, mikobakteri ve mantarları referans y�ntemi ile %90-100 d�zeyinde uyumlu olarak doğru tanımladığı saptanmıştır2,3.

"Eosin methylene blue (EMB)" agar, gram-negatif bakteriler i�in se�ici ve ayırt edici bir besiyeridir. Yaklaşık 100 yıl �nce Levine4 tarafından geliştirilen bu besiyeri, �lkemizde en �ok kullanılan gram-negatif se�ici besiyeridir ve t�m d�nyada mikrobiyoloji laboratuvarlarında halen yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu besiyerinde bulunan eozin Y ve metilen mavisi boyaları (6/1) gram-pozitif bakterilerin �remesini baskılarken Enterobacteriaceae �yeleri ve bir�ok gram-negatif non-fermentatif bakterinin �remesini desteklemektedir. �reyen bakteri t�rleri, metabolik �zelliklerine g�re besiyerinde bulunan bu iki boya maddesini farklı d�zeylerde absorbe ederek kendilerine �zg� koloni morfolojisi oluşturur. Bu �zellik, Escherichia coli gibi bazı bakterilerin erken tanısına olanak sağlarken, aynı zamanda �oklu gram-negatif �remelerinde farklı patojen kolonilerinin ayırt edilmesini de sağlar.�� �

MALDI-TOF MS ile tanımlanacak bakteriler i�in �nerilen �retilme ortamları belirlenmiştir. Bakteriler i�in toplam yedi farklı besiyeri �nerilmekte olup gram-negatif bakteriler i�in sadece bir se�ici besiyeri (MacConkey agar) bu ama�la referans olarak �nerilmektedir1. Bu durum rutin laboratuvar uygulamalarında bazı sorunlara yol a�maktadır. �rneğin; sadece MALDI-TOF MS i�in mikrobiyologların besiyeri kullanım tercihlerini değiştirmeleri gerekmektedir. Bazı kullanıcılar bunun yerine, �reticiler tarafından referans verilmiş olan kanlı agar besiyerinden MALDI-TOF MS tanımlaması yapmayı yeğlese de �zellikle birden fazla gram-negatif bakteri t�r�n�n �rediği �rneklerde, kanlı agarda �reyen farklı gram-negatif kolonilerin birbirinden ayrıştırılmasında sorun yaşanmaktadır. B�yle bir durumda EMB agar besiyerinde �reyen farklı gram-negatif kolonilerden kanlı agara pasaj yapılarak bu sorun giderilmeye �alışılmasına rağmen MALDI-TOF MS'nin klinik tanıya kattığı en �nemli avantaj olan "hızlı tanı" �zelliği kaybedilmektedir. Buna karşın, bazı laboratuvarlar EMB agar besiyerinden direkt olarak MALDI-TOF MS tanımlama yapmakta ancak elde edilen sonu�ların doğruluğu hakkında �nemli bir veriye sahip bulunulmamaktadır. Ayrıca, MALDI-TOF MS i�in farklı besiyeri alternatiflerinin belirlenmesi hem mikrobiyolojik tekniklerin geliştirilmesi hem de geleceğin klinik tanısı i�in �mit vadeden bu y�ntemin kullanım potansiyelinin arttırılması adına �nemlidir.�

Bu �alışmada, MALDI-TOF MS'nin EMB agarda �reyen gram-negatif bakteri tanımlama performansının saptanması ama�lanmış ve �zellikle kolonilerin �reme d�neminde besiyerinden absorbe ettiği boyaların uzaklaştırılması amacına dayanan basit bir koloni yıkama y�ntemi geliştirerek tanı performansının arttırılması hedeflenmiştir. Bu �alışmanın sonu�ları, �zellikle EMB agar tercihi devam eden veya sınırlı mali kaynaklar nedeniyle farklı se�ici ve ayırt edici besiyeri alımını planlamayan mikrobiyoloji laboratuvarları i�in daha fazla �nem arz etmektedir.

GERE� ve Y�NTEM

�alışma Planı

Bu �alışma, prospektif olarak 1200 yataklı bir �niversite hastanesinin mikrobiyoloji laboratuvarında yapıldı. Aralık 2016-Haziran 2017 tarihleri arasında rutin klinik �rneklerden elde dilen toplam 468 gram-negatif izolat �alışıldı. Aynı hastanın yalnız bir izolatı �alışmaya dahil edildi.

K�lt�r ve Tanımlama���

İdrar, kan, balgam, p�y, s�r�nt�, beyin omurilik sıvısı (BOS), dışkı, eklem sıvısı ve kateterden oluşan klinik �rnekler %5 koyun kanlı agar ve EMB agar besiyerlerine (Oxoid, Birleşik Krallık); gerektiğinde �ikolata agar, Sabouraud dekstroz agar (SDA) ve Salmonella-Shigella (SS) agar (Oxoid, Birleşik Krallık) besiyeri de kullanılarak ekildi. Plaklar 35C'de 18-24 saat ink�be edildikten sonra değerlendirildi. �reyen gram-negatif bakteriler klasik bakteriyolojik y�ntemler5, MicroScan WalkAway 96 Plus (Backman Coulter Inc., ABD) otomatik tanımlama cihazı ve Vitek MS (Bio M�rieux, Fransa) MALDI-TOF MS ile t�r d�zeyinde tanımlandı.�

Tam olarak tanımlanamayan veya tanısında uyumsuzluk bulunan izolatların tanısı 16S rDNA dizileme y�ntemi ile yapıldı. Kısaca, "broad-range eubacterial primer"ler kullanılarak 16S rDNA'ya ait 800 baz �iftlik b�lge PCR ile �oğaltıldı ve amplikonlar %2'lik agaroz jel elektroforezi ile ayrıştırıldı. Qiaquick PCR kiti (Qiagen, Hilden, Almanya) ile saflaştırılan amplikonların, "Bigdye Terminator V3.1 cycle" dizileme kiti kullanılarak ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, ABD) cihazında dizi analizi ger�ekleştirildi. Elde edilen dizi verisi blast sunucusunda (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) bulunan BLASTn programına y�klendi, MegaBLASt algoritma ve n�kleotit toplama (nr/nt) taramaları se�ildi. Sorgu kapsamı %99, E-değeri 0.0 ve maksimum tanım %99 olarak kabul edilerek izolatlar tanımlandı.

Bir izolat tanımlandıktan sonra bu t�r�n EMB agardaki kolonilerden hem direkt olarak ve hem de yıkama işlemi sonrası MALDI-TOF MS tanımlaması yapıldı. Kısaca, 1 �l steril �ze ile alınan bakteri kolonisi �elik hedef plaktaki okuma halkasına usul�ne uygun olarak s�r�ld� ve �zerine 1 �l matriks ��zeltisi (-cyano-4-hydroxycinnamic acid; CHCA) eklenerek cihaza y�klendi. Her izolat 100 lazer atışı ile Vitek MS (Bio M�rieux, Fransa) cihazı ile "In Vitro Diagnostic (IVD)" mod�l� V3.0 veri tabanı ile tanımlandı. E.coli ATCC 8739 i� kalite kontrol ve sistem kalibrat�r� olarak kullanıldı.

Yıkama İşlemi

Steril bir �ze yardımıyla EMB agarda �reyen bakteri kolonilerinden 1-4 adet alındı ve 1.5 ml steril propilen mikrosantrif�j t�p i�inde bulunan 300 �l steril fizyolojik tuzlu suda s�spanse edildi. Tam olarak homojen dağılmayan �rnekler 1-3 dakika vortekslenerek homojenize edildi. T�pler 8000 rpm'de 4 dakika santrif�j edildi ve �stteki sıvı pipetle aspire edilerek atıldı. Daha sonra her t�p i�ine 300 �l etanol (%70) eklenerek bakteriler tekrar homojenize edildi. Tam olarak homojen dağılmayan �rnekler 1-3 dakika vorteks karıştırıcı ile homojenize edildi. T�pler 8000 rpm'de 4 dakika santrif�j edildi ve bu işlem 2 kez daha tekrarlandı. Son santrif�j sonrası �stteki sıvı atıldı ve dipteki yıkanmış bakteri ��zeltisinden 1 �l steril �ze ile �rnek alınarak okuma plağı �zerindeki halkaya s�r�ld�. Matriks ��zeltisi uygulaması sonrası yukarıda detayları verildiği şekilde bakteri tanımlaması yapıldı.

Yıkama işleminin iş akışını g�steren şema Şekil 1'de g�sterilmiştir.


Şekil 1

Veri Analizi

�alışılan t�rlerin EMB agardan direkt ve yıkama sonrası elde edilen t�r d�zeyinde tanımlama oranları hesaplandı. Kalitatif veriler sayı ve oran olarak ifade edildi. McNemar test ile her iki okuyuşa ait veriler istatistiksel olarak karşılaştırıldı. T�m analizler i�in p< 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.��

BULGULAR

Yirmi farklı cins ve 37 farklı t�rden olmak �zere toplam 468 gram-negatif klinik izolat �alışılmıştır. Bunlardan 275'i Enterobacteriaceae ailesinden (12 cinsten 22 farklı t�r) geri kalan 193 izolat ise sekiz farklı cinsten 14 farklı t�r olmak �zere aerobik gram-negatif basil olarak belirlenmiştir.

EMB agardan direkt MALDI-TOF MS okumasında, 468 izolatın 382'si (%81.6) t�r d�zeyinde doğru olarak tanımlanmıştır. Cihaz, 80 (%17) izolatı zayıf spektrum nedeniyle tanımlayamamıştır ve d�rd� cins d�zeyinde olmak �zere toplam altı (%1.2) izolat ise yanlış tanımlanmıştır. Bu okumada Stenotrophomonas maltophilia, Klebsiella oxytoca, Salmonella spp. ve Proteus mirabilis başta olmak �zere 14 farklı t�r�n hepsi tam olarak (%100) tanımlanırken en d�ş�k tanı oranı Providencia spp. (%62.5), E.coli (%70.5) ve Acinetobacter spp. (%70.7) t�rlerinde saptanmıştır. Yıkama işlemi sonrasında 434 (%92.7) izolat doğru tanımlanmıştır, 30 (%6.4) izolat zayıf spektrum nedeniyle tanımlanmamıştır ve ikisi cins d�zeyinde olmak �zere toplam d�rt (%0.85) izolat ise yanlış tanımlanmıştır.

İstatistiksel �alışma, yıkama işleminin cihazın EMB agardan yapılan tanımlama performansını toplamda anlamlı d�zeyde arttırdığı g�stermiştir (%81.4 vs. %92.7, p= 0.001). Yıkama sonrasında �alışılan 20 gram-negatif bakteri cinsinin 12'sinde doğru tanı oranının arttığı saptanırken bunlardan Acinetobacter spp. (%70.7 vs. 87.8; p= 0.001) ve E.coli'de (%70.5 vs. %88.6; p= 0.001) g�r�len artışlar istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur.�

Bu �alışmaya alınan bakteri t�rleri ve EMB agardan direkt ve yıkama sonrası elde edilen tanımlama oranları Tablo I'de g�sterilmiştir.


Tablo I

TARTIŞMA

Gram-negatif bakteriler, hem hastane hem de toplum k�kenli enfeksiyonların �nemli patojenleridir. �alışmalarda, Enterobacteriaceae ailesi �yeleri ile Pseudomonas spp. ve Acinetobacter spp. gibi fermentatif olmayan etkenlerin sağlık hizmeti ilişkili enfeksiyonlarda en sık g�r�len ilk beş etken arasında olduğunu ve bunların t�m hastane enfeksiyonlarının %60'ından fazlasına neden olduğu bildirilmiştir6-9.��

Klinik uygulamada gram-negatif enfeksiyonların y�netimi; patojen t�r sayısının fazla olması, t�rlerin taşıdığı farklı doğal diren� �zellikleri sonucu farklı antimikrobiyal tedaviler gerektirmeleri ve hızla artan kazanılmış antimikrobiyal diren� nedeniyle sorunludur10,11. Bu t�r etkenlerin tanımlanma s�recinin kısaltılması uygun tedavinin erkenden başlanması a�ısından �nemli olup uygun antimikrobiyal tedavinin erken başlanması ile pozitif bulunan hasta sonu�ları arasında g��l� ilişki bulunduğu bildirmektedir12. Ayrıca, patojenlerin erken tanısı hastane enfeksiyon kontrol �nlemleri a�ısından da �nemli olup �zellikle salgın d�nemlerinde en uygun enfeksiyon kontrol tedbirlerinin erkenden alınarak patojenin yayılımı sınırlandırılmasına olanak tanınabilmektedir. Dolayısıyla gram-negatif bakterilerin erken ve doğru tanısı sadece mikrobiyologlar i�in değil aynı zamanda kritik hasta tedavisi ile ilgilenen diğer tıp branşları i�in de g�ncel bir konu olmuştur. Bu bilgiler ışığında, MALDI-TOF MS'nin son yıllarda kullanıma girmesi ile birka� g�n s�rebilecek tanımlama işlemlerini beş dakikadan kısa s�rede; ayrıca daha az iş g�c� ve daha az kimyasal kit t�keterek ve laboratuvar �alışanlarının daha az patojen maruziyeti ile tamamlanması olası hale gelmiştir. Dolayısıyla �mit vadeden bu sistemin potansiyelinin saptanması ve işlevselliğinin arttırılması MALDI-TOF MS'nin klinik tanıya daha fazla katkı sağlayabilmesine yardımcı olacaktır.

EMB agar, gram-negatif bakteriler i�in se�ici ve ayırt edici bir besiyeridir. Bu besiyeri karbonhidrat kaynağı olarak laktoz ve s�kroz; azot kaynağı olarak da pepton i�erir. E.coli gibi bazı bakteriler, her iki karbonhidratı fermente ederek asidik son �r�nler �retimi yoluyla mikro �evrenin pH'sını azaltır. Bu s�re�, b�y�yen kolonilerin eozin Y ve metilen mavisi boyalarını absorbe etmesine neden olur13. Sonu� olarak, her bir t�r bu besin maddelerini farklı seviyelerde kullanır ve dolayısıyla EMB agar �zerinde �reyen koloniler metalik yeşil, pembe, kırmızımsı, mavi veya saydam gibi farklı renklerde g�r�nerek ayrıştırılabilir. Bu nedenle, EMB agar rutin bakteriyolojik k�lt�rler; �zellikle dışkı, solunum �rnekleri, yara enfeksiyonları, idrar ve p�y �rnekleri i�in vazge�ilmez bir besiyeri olmuştur.

MALDI-TOF MS i�in gram-negatif se�ici besiyeri olarak g�n�m�ze kadar sadece MacConkey agar �nerilmiştir. Bu besiyeri i�eriğinde bulunan kristal viyole, gram-pozitiflerin �remesini engellerken gram-negatiflerin gelişmesine m�saade eder14. MacConkey ve EMB agar besiyerlerinin rutin uygulamada birbirine karşı �st�nl�kleri hakkında fazla sayıda bilimsel �alışma bulunmamaktadır. Ancak, Leininger ve arkadaşları15, mikrobiyologlar i�in EMB'nin �zellikle E.coli gibi �ok sık izole edilen gram-negatif patojenin kendine �zg� parlak metalik yeşil r�fleli olarak �remesini sağlaması nedeniyle daha yararlı olabileceğini bildirmişlerdir. Anderson ve arkadaşları16 2012 yılında MALDI-TOF MS'nin MacConkey agar ile olan tanı performansını araştırdıkları �alışmada, Enterobacteriaceae �yeleri i�in t�r d�zeyinde tanı oranını %88 olarak saptamış ve uyguladıkları protein ekstraksiyon işlemi sonrası bu değerin %96'ya y�kseldiğini bildirmişlerdir. Aynı �alışmada yazarlar Pseudomonas spp. i�in MacConkey'den yapılan tanımlamada t�r d�zeyi tanı oranını %52 olarak bulmuş ve uyguladıkları ekstraksiyon sonrası bu değerin %70'e y�kseldiğini saptamışlardır. Bir başka �alışmada ise Bizzini ve arkadaşları17, yaklaşık 700 gram-negatif izolat i�in MALDI-TOF MS'nin tanı performansını araştırmış ve MacConkey agarda saptanan tanı değerinin, koyun kanlı agar veya �ikolata agardan yapılan tanımlamaya g�re istatistiksel olarak anlamlı d�zeyde d�ş�k olduğunu bildirmişlerdir. Bununla birlikte, g�n�m�ze kadar, MALDI-TOF MS'nin teknolojisi, işletim yazılımı ve veri tabanlarının �nemli �l��de iyileştirilmiş olmasına rağmen gram-negatif se�ici ortamlara g�re bu y�ntemin performansının �alışıldığı dikkate değer bir başka araştırma yapılmamış olup EMB agar hakkında ise hi�bir veri mevcut değildir.

Bu �alışmada, MALDI-TOF MS'nin EMB agarda �reyen gram-negatif bakterilerin %80'inden fazlasını doğru olarak tanımlayabildiği saptanmıştır. Doğrudan EMB'den yapılan okumada MALDI-TOF MS'nin tanımlama performansı, nispeten daha az renkli, yarı saydam veya şeffaf kolonilere sahip t�rlerde m�kemmele yakın d�zeyde y�ksek bulunmuştur. Buna karşın, yoğun d�zeyde boya absorbe eden kolonilere sahip bakteri t�rleri (�rneğin, Acinetobacter spp. ve E.coli) i�in ise bu oran %70 dolayında saptanmıştır. Dolayısıyla �alışmamızda, bu boyaların giderilmesinin MALDI-TOF MS'nin EMB besiyerindeki tanı performansını artırabileceği olasılığına odaklanılmış ve sonu� olarak, temel laboratuvar ekipmanlarıyla yapılabilecek, basit, hızlı (ortalama 10 dakika, en fazla 30 dakika) ve d�ş�k maliyetli (< 1 USD/izolat) bir boya yıkama y�ntemi geliştirilmiştir. Bu işlemden sonra, EMB'de �retilen bakteri t�rleri i�in MALDI-TOF MS'nin tanı performansında �nemli iyileşmeler g�r�lm�ş ve �alışılan suşların toplam doğru tanı oranının %92'yi aştığı saptanmıştır. Yıkama işlemi, �alışmaya alınan 20 cins bakteriden 12'sinin tanımlama oranlarında %5.7 ila %33.4 d�zeyinde y�kselme sağlarken altı cinsin tanı oranında değişim olmamıştır. Ancak tanı oranında değişim sağlanmayan bu altı cins bakterinin yıkama �ncesi tanı oranlarının m�kemmel d�zeyde (%100) olduğu g�r�lm�şt�r. Yıkama ile �zellikle Acinetobacter spp., E.coli, Providencia spp., Citrobacter spp., ve Enterobacter spp. t�rlerinin tanı oranlarında en y�ksek artışlar sağlanırken bunlardan Acinetobacter spp. ve E.coli'deki artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (Tablo I).

EMB besiyerinden yapılan direkt okumada toplam 80 izolat zayıf spektrum nedeniyle tanımlanamamıştır. Buna karşın, yeterli spektrum elde edilemeyen izolat sayısında yıkama işlemi ile %60'tan fazla azalması sağlanmıştır. Ayrıca bu işlem sonrası, bir Acinetobacter johnsonii izolatı hari� olmak �zere direkt EMB okumasında yanlış tanımlanan t�m izolatlar doğru tanımlanmıştır. Diğer taraftan, yıkama işlemi ile tanımlama g�ven değerinin de [confidence level (CL)] y�kseldiği g�zlenmiş olup direkt okumada iki A.baumannii, iki E.coli, bir K.pneumoniae, bir C.freundii ve bir C.brakii d�ş�k CL değeri (%50 ile 73.8%) ile tanımlanmışken yıkama sonrası bu izolatların hepsi y�ksek g�ven d�zeyinde (%99.5 ila %99.9) tanımlanabilmiştir (veri g�sterilmemiştir).

Diğer taraftan, bu �alışmada yıkama işleminin bazı t�rlerin tanımlama s�re�lerine negatif etkisinin olabileceği de saptanmıştır. �alışmamızda, direkt EMB okumasında doğru tanımlanmışken yıkama sonrası toplam d�rt izolatın (bir Acinetobacter radioresistent, bir Citrobacter koserii, bir Hafnia alvei ve bir Rauoltella planticola) zayıf spektrum nedeniyle tanımlaması yapılamamıştır. Ayrıca, toplam �� izolat (bir Pseudomonas putida, Serratia marcescens ve bir Providencia stuartii) direkt EMB okumasında doğru tanımlanmışken yıkama sonrası yanlış tanımlanmıştır. Ancak yıkama işlemi sonrası ortaya �ıkan
tanımlayamama/yanlış tanımlama sorununun �alışılan toplam suşların olduk�a az bir kısmında (yaklaşık %1.5) saptanmış olması, bu d�ş�ş�n doğru bir şekilde analiz edilmesi i�in �zellikle hata saptanan t�rlerden daha fazla izolatın bu ama�la test edilmesi gerektiğini d�ş�nd�rm�şt�r.

Eosin Y (C20H8Br4O5.2Na; molek�ler ağırlık: 691 g/mol), �karyotik ve prokaryotik h�cre yapılarında proteinlerle etkileşime giren ve etanolde ��z�nebilen asidik bir kırmızı boyadır. Metilen mavisi (C16H18CIN3S; molek�ler ağırlık: 319 g/mol), n�kleik asitler ve bazı asidik proteinlere bağlanarak onları boyayan su ve etanolde ��z�nebilen bazik bir boyadır. Bu �alışmada, �reme esnasında besiyerinden absorbe edilen bu iki boyanın gram-negatif bakteri kolonilerinden uzaklaştırılmasının MALDI-TOF MS'nin tanı performansını arttırabildiği g�zlenmiştir. Bu sonuca dayanarak, bazı olası mekanizmaların bu iyileşmede rol oynadığı d�ş�n�lm�şt�r. İlk olarak; bu iki boya, bakteriyel proteinlere bağlanarak onların molek�ler k�tlelerini değiştirebilir ve bu nedenle direkt okumada cihaz tarafından tespit edilen k�tlesel protein spektrumlarının referans spektrumla uyumsuzluk g�stermesinden dolayı tanımlama sorunu oluşturmuş olabilir. Ger�ekten de �alışmamızda saptadığımız en �nemli tanı sorunu zayıf spektrum nedeniyle anlamlı bir tanımlama yapılamamış olmasıdır. İkinci olarak, bu iki boyanın matriks ��zeltisi ile olabilecek potansiyel etkileşimleri, matriksin bakteriyel proteinleri etkili bir şekilde kristalize etme �zelliğini bozuyor olabilir. ���nc� olarak, EMB besiyerinin i�erdiği besinsel �ğe kompozisyonu tanımlama i�in �nemli olabilecek bazı proteinlerin ekspresyonunda değişime neden olmuş olabilir. Dolayısıyla boyaların ve besiyeri i�eriğinin EMB'de �reyen gram-negatif bakterilerin protein spektrumları �zerindeki etkisini anlamak i�in daha fazla �alışmaya gereksinim bulunmaktadır.

Maldi-Tof MS �reticileri tarafından gram-negatif se�ici besiyeri olarak �nerilen MacConkey agarın araştırmamıza dahil edilmemiş olması bu �alışma ile ilgili bildirmemiz gereken en �nemli sınırlılıklardan biridir.

Bu �alışmada, EMB agarda �reyen gram-negatif bakterilerin MALDI-TOF MS ile kabul edilebilir bir d�zeyde tanımlanabildiği ve bu �alışmada tanımlanan basit bir yıkama işlemi ile tanı performansının iyi bir d�zeye y�kseltilebileceği saptanmıştır. Bu �alışmanın sonu�larına g�re; �nemli bir patojen topluluğu olan gram-negatif bakterilerin MALDI-TOF MS ile tanısında pratikte karşılaşılan "sınırlı besiyeri" sorununa karşı mikrobiyolojik olarak geleneksel bir besiyeri olan EMB agarın alternatif bir ��z�m olabileceği vurgulanmıştır.

�IKAR �ATIŞMASI

Yazarlar bu makale ile ilgili herhangi bir �ıkar �atışması bildirmemişlerdir.

KAYNAKLAR

  1. Vitek MS V3.0 Database for clinical usage. BioM�rieux SA, France, 2016.
  2. Kassim A, Pfl�ger V, Premji Z, Daubenberger C, Revathi G. Comparison of biomarker based Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) and conventional methods in the identification of clinically relevant bacteria and yeast. BMC Microbiol 2017;17(1):128.
  3. Miller E, Cantrell C, Beard M, Derylak A, Babady NE, McMillen T, et al. Performance of Vitek MS v3.0 for identification of Mycobacterium species from patient samples by use of automated liquid medium systems. J Clin Microbiol 2018;56(8):e00219-18.
  4. Levine M. Differentiation of E.coli and A.aerogenes on a simplified eosin methylene blue agar. J Infect Dis 1918;23;43-7.
  5. Washington W Jr, Koneman EW, pp:213-315. In: Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 7th Edition, 2016. Lippincott Williams&Wilkins, Philadelphia.
  6. Metsini A, Vazquez M, Sommerstein R, Marschall J, Voide C, Troillet N, et al. Point prevalence of healthcare-associated infections and antibiotic use in three large Swiss acute-care hospitals. Swiss Med Wkly 2018;148: w14617.
  7. Walter J, Haller S, Quinten C, Karki T, Zacher B, Eckmanns T, et al. Healthcare-associated pneumonia in acute care hospitals in European Union/European Economic Area countries: an analysis of data from a point prevalence survey, 2011 to 2012. Euro Surveill 2018;23(32).
  8. Marani A, Napoli C, Berdini S, Montesano M, Ferretti F, Di Ninno F, et al. Point prevalence surveys on healthcare acquired infections in medical and surgical wards of a teaching hospital in Rome. Ann Ig 2016;28(4):274-81.
  9. Erdem H, Inan A, Altındis S, Carevic B, Askarian M, Cottle L, et al. Surveillance, control and management of infections in intensive care units in Southern Europe, Turkey and Iran--a prospective multicenter point prevalence study. J Infect 2014;68(2): 131-40.
  10. Durdu B, Kritsotakis EI, Lee ACK, Torun P, Hakyemez IN, Gultepe B, et al. Temporal trends and patterns in antimicrobial-resistant Gram-negative bacteria implicated in intensive care unit-acquired infections: a cohort-based surveillance study in Istanbul, Turkey. J Glob Antimicrob Resist 2018;14:190-6.
  11. Guducuoglu H, Gursoy NC, Yakupogullari Y, Parlak M, Karasin G, Sunnetcioglu M, et al. Hospital outbreak of a colistin-resistant, NDM-1- and OXA-48-producing Klebsiella pneumoniae: high mortality from pandrug resistance. Microb Drug Resist 2018;24(7):966-72.
  12. Dimopoulos G, Koulenti D, Tabah A, Poulakou G, Vesin A, Arvaniti K, et al. Bloodstream infections in ICU with increased resistance: epidemiology and outcomes. Minerva Anestesiol 2015;81(4):405-18.
  13. Eosine Methylene Blue Agar. HiMedia Laboratories Technical Data Sheet. HiMedia Laboratories, India. Available at: http://www.himedialabs.com/TD/M317.pdf. Erişim tarihi: 3 Haziran 2018.
  14. MacConkey AT. Note on a new medium for the growth and differentiation of the Bacillus coli communis and the Bacillus typhi abdominalis. Lancet 1900;156(4010):20.
  15. Leininger DJ, Roberson JR, Elvinger F. Use of eosin methylene blue agar to differentiate Escherichia coli from other gram-negative mastitis pathogens. J Vet Diagn Invest 2001;13(3):273-5.
  16. Anderson NW, Buchan BW, Riebe KM, Parsons LN, Gnacinski S, Ledeboer NA. Effects of solid-medium type on routine identification of bacterial isolates by use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 2012;50(3):1008-13.
  17. Bizzini A, Durussel C, Bille J, Greub G, Prod'hom G. Performance of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for identification of bacterial strains routinely isolated in a clinical microbiology laboratory. J Clin Microbiol 2010;48(5):1549-54.

İletişim (Correspondence):

Prof. Dr. Yusuf Yakupoğulları,

İn�n� �niversitesi Tıp Fak�ltesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

Malatya, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 505 278 2275,

E-posta (E-mail): yusufyakoup@yahoo.com

Yazdır