Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2017; 51(1): 52-61

Akut Toksoplazmozlu Fare Modelinde Azitromisin ve Chlorella vulgaris'in
Tedavi Etkinliğinin, NK Aktivasyonu ve Bazı Sitokin Değerlerinin Araştırılması

Effects of Azithromycin and Chlorella vulgaris Treatment on Certain Cytokine Values and
NK Cell Activity in an Acute Murine Toxoplasmosis Model

Deniz G�zde �ELİK PAY�U1, �zden B�Y�KBABA BORAL1

1 İstanbul �niversitesi İstanbul Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul.

1 Istanbul University Istanbul Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Istanbul, Turkey.

�Z

Toksoplazmoz, karmaşık tedavi s�reci olan yaygın bir enfeksiyondur. Azitromisin (AZT) yan etkileri az, ok�ler ve serebral toksoplazmozlu hastalarda etkin olarak kullanılan makrolid grubu bir antibiyotiktir. Chlorella vulgaris (CV), besleyici maddeler i�eren ve �eşitli biyolojik etkilere sahip tek h�creli yeşil algdir. CV ekstresinin (CVE) �eşitli bakteri ve virusların neden olduğu enfeksiyonlarda �zellikle doğal �ld�r�c� (Natural Killer) (NK) h�crelerin sitotoksik aktivitelerini ve IL-12 ve IFN- d�zeylerini arttırarak imm�n sistemin aktivasyonuna katkıda bulunup enfeksiyonlara karşı koruyucu etki oluşturduğu belirlenmiştir. Bu �alışmada; akut toksoplazmozlu farelerde, azitromisin ve CVE'nin tek tek ve birlikte kullanıldığında tedaviye, IL-2, IL-12, IFN- sitokin seviyeleri ile NK h�crelerinin sitotoksik aktivitelerine etkisinin araştırılması ama�lanmıştır. Her biri sekiz fareden (Balb/c) oluşan beş deney grubu oluşturulmuş ve bir gruba (sağlıklı kontrol-SK) hi�bir işlem yapılmamıştır. Diğer gruplara 11 x 104 trofozoit/ml olacak şekilde 1 ml Toxoplasma gondii RH� suşu� trofozoiti intraperitoneal yolla verilmiştir. Enfekte Kontrol (EK) grubuna� başka bir işlem yapılmamıştır. Diğer gruplara ise trofozoit verildikten 24 saat sonra oral gavaj ile CV grubuna CVE, AZT grubuna azitromisin, CV + AZT grubuna CVE ve azitromisin birlikte 6 g�n boyunca verilmiştir. EK, CV, AZT, CV + AZT grubuna ait t�m fareler 8. g�nde ketamin ile anestezi uygulanarak, periton sıvıları, kalp kanı ve dalakları alınmıştır. Bu grupların periton sıvılarında trofozoit sayıları belirlenmiş, tedavi gruplarının ortalama trofozoit sayılarıyla b�y�me inhibisyon aktiviteleri hesaplanmıştır. SK dahil t�m grupların serum �rneklerinde IL-2, IL-12, IFN- d�zeyleri ELISA, dalak NK h�crelerinin sitotoksik aktiviteleri "Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay" ile saptanmıştır. CV, AZT ve CV + AZT gruplarında trofozoit sayıları EK grubuna g�re anlamlı derecede d�ş�k saptanmıştır (p< 0.001). AZT tedavi grubu %98,46; CV grubu %88.6 ve AZT + CV kombinasyon tedavi grubu %99.4 oranlarında EK grubuna g�re T.gondii'ye karşı antiprotozoal etki g�stermiştir. NK h�cre sitotoksisiteleri CV, AZT + CV gruplarında, diğer gruplardan anlamlı oranda y�ksek bulunmuştur. IL-12, IFN- seviyeleri uyumlu olup EK grubunda en y�ksek, AZT + CV grubunda en d�ş�k saptanmış (p< 0.001), bu durum enfeksiyonun şiddetinin olduk�a d�şm�ş olması ile ilişkilendirilmiştir. IL-2 d�zeyleri CV, CV + AZT gruplarında diğer gruplardan anlamlı oranda y�ksek saptanmıştır (p< 0.001). �alışmamızda CV'nin tek başına uygulanması bile enfeksiyonda y�ksek oranlarda gerilemeye neden olmuştur. Bu durum NK sitotoksisitesi, IL-2, IL-12 ve IFN- d�zeylerindeki artışla ilişkili olabilir. Azitromisinin CV ile birlikte uygulanması T.gondii eliminasyonunda y�ksek başarı g�stermesi, diğer y�ntemleri tolere edemeyen ve imm�n sistemi baskılanmış hastalarda bir tedavi se�eneği olabileceğini d�ş�nd�rmektedir.

Anahtar s�zc�kler: Toksoplazmoz; azitromisin; Chlorella vulgaris; sinerjizm; tedavi.

ABSTRACT

Toxoplasmosis is a common infection with a complicated treatment process. Azithromycin (AZT) is a macrolide antibiotic that can be effectively used in patients with cerebral and ocular toxoplasmosis and has fewer side effects. Chlorella vulgaris (CV), a single-cell green algae that contains nutrients and has various biological effects. CV extract (CVE) has been shown to have protective effects against infections via immune enhancement by increasing the cytotoxicity of NK cells, IL-12 and IFN- levels. The aim of this study was to investigate the protective effects of AZT and CV, individually and in combination, against acute toxoplasmosis in mice, and their effects on NK cell cytotoxixity, IL-12, IFN-, and IL-2 levels. Six groups of mice (Balb/c) were formed. With the exception of the healthy control (HC) group, all other groups were infected with 1 ml (11 x 104� trofozoit/ml) Toxoplasma gondii RH strain trophozoites. No further action was performed for infected control (IC) group. After 24 hours from trophozoite infection, CVE was given to CV group, AZT to azithromycin group and CVE + AZT combination to CV + AZT group by oral gavage for 6 days. All of the mice from IC, CV, AZT and CV + AZT groups were sacrified on the 8th day of the infection and serum, peritoneal fluid and spleen samples were collected. Trophozoite count of the groups were determined in all groups except HC group and the average growth inhibition activity was calculated by using the growth inhibition formula. In all groups IL-12, IFN-, IL-2 levels were measured with ELISA method and cytotoxicity of the NK cells were measured using Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay. The number of trophozoites were significantly lower in the CV group than the IC group (p< 0.001), and also significantly lower in CV + AZT combination group than the AZT group. According to the growth inhibition calculations CV treatment showed 88.6%, AZT treatment 98.46%, AZT + CV combination treatment 99.4% antiprotozoal activity against T.gondii compared with the IC group. NK cell cytotoxicity in the CV and the combination group were significantly higher than all the other groups (p< 0.001). IL-12 and IFN- levels were highest in IC group and the lowest in AZT + CV group. This situation has been linked to the fact that the severity of the infection has fallen considerably. IL-2 levels were significantly higher in CV, CV + AZT groups than in the other groups (p< 0.001). In our study, even CV administration alone caused a significant decline in infection.This may be related to the increased NK cytotoxicity, IL-2, IL-12 and IFN- levels. CV + AZT combination seems to be an effective treatment option than AZT alone, particularly in patients who are difficult to treat with common methods or in patients with immunosuppression.

Keywords: Toxoplasmosis; azithromycin; Chlorella vulgaris; synergism; treatment.

Geliş Tarihi (Received): 10.08.2016 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 06.01.2017

GİRİŞ

Toksoplazmoz, d�nyada yaygın olarak g�r�len Toxoplasma gondii'nin neden olduğu bir enfeksiyondur. İnsanlara hamilelik sırasında bulaşarak yenidoğanda ve imm�n sistemi baskılanmış hastalarda ciddi klinik tablolara neden olmaktadır. Toksoplazmoza karşı konakta h�cresel ve h�moral bağışık yanıt rol oynamaktadır. Laboratuvar hayvanlarında yapılan �alışmalarda interferon-gama (IFN-) ve interl�kin� IL-12 d�zeyinin savunmada �nemli olduğu g�sterilmiştir.1,2 Ayrıca yapılan �alışmalarda toksoplazmoza karşı, IFN-'nin en etkili sitokin olduğu ve IFN- salgılanmasına bağlı olarak, IL-12, IL-2, IL-7 gibi sitokinlerin de dolaylı olarak salgılandığı ve toksoplazmoza karşı koruyucu etkilerinin olduğu g�sterilmiştir.3 Doğal �ld�r�c� (NK) h�crelerden salınan IFN-'nın makrofaj aktivasyonunu sağladığı, IL-12'nin ise deneysel olarak T.gondii enfeksiyonu oluşturulan T h�cresiz farelerde NK h�crelerinden IFN- salınımını arttırarak toksoplazmik ensefalit gelişimini engellediği g�sterilmiştir.4,5 Tedavide primetamin, sulfadiyazin, trimetoprim s�lfametoksazol�n yanı sıra klindamisin, spiramisin, atovakuon, azitromisin, roksitromisin gibi ila�lar kullanılmaktadır. Azitromisin yan etkilerinin az olması nedeni ile �zellikle ok�ler ve serebral toksoplazmozlu hastalarda etkin olarak kullanılan makrolid grubu bir antibiyotiktir6. Chlorella vulgaris (CV), besleyici maddeler i�eren ve �eşitli biyolojik etkilere sahip tek h�creli yeşil bir algdir. Yapılan �alışmalarda Chlorella vulgaris ekstresinin (CVE) enfeksiyonlarda �zellikle doğal �ld�r�c� (NK) h�crelerin sitotoksik aktivitelerini ve IL-1, IL-12 ve IFN- d�zeylerini arttırarak imm�n sistemin aktivasyonuna katkıda bulunduğu, bu yolla enfeksiyonlara karşı koruyucu etki oluşturduğu belirlenmiştir7,8.

Bu �alışmada; deneysel olarak T.gondii ile enfekte edilen farelerde, azitromisin ve CVE'nin tek tek ve birlikte kullanıldığında tedaviye katkısının ve IL-2, IL-12, IFN- sitokin seviyeleri ile NK h�crelerinin sitotoksik aktivitelerine etkisinin olup olmadığının araştırılması ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

Bu �alışmanın yapılması i�in gerekli etik kurul onayı İstanbul �niversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu'ndan 2015/41 sayı ve karar numarası ile alınmıştır. Deneyler s�resince hayvan haklarının korunmasına �zen g�sterilmiştir.

Her biri sekiz Balb/c fareden oluşan beş deney grubu oluşturulmuş ve bir gruba (Sağlıklı Kontrol-SK) hi�bir işlem yapılmamıştır. Diğer gruplara ise 1 ml T.gondii RH suşu� trofozoiti (11 x 104 trofozoit/ml) intraperitoneal yolla verilmiştir. Enfekte Kontrol (EK) grubuna� başka bir işlem yapılmamıştır. Diğer gruplara ise trofozoit verildikten 24 saat sonra oral gavaj ile CV grubuna CVE, AZT grubuna azitromisin, CV + AZT grubuna CVE ve azitromisin birlikte verilmiştir. EK, CV, AZT, CV + AZT grubuna ait t�m fareler 8. g�nde ketamin ile anestezi uygulanarak, periton sıvıları, kalp kanı ve dalakları alınmıştır9,10 (Tablo I).


Tablo I

SK hari� grupların periton sıvılarında trofozoit sayıları belirlenmiş, tedavi gruplarının ortalama trofozoit sayılarıyla b�y�me inhibisyon aktiviteleri Muelas-Serrana'nın11 �nerdiği aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanmıştır;��

T�m grupların serum �rneklerinde IL-2, IL-12, IFN- d�zeyleri ELISA y�ntemi (e-Biyoscience, Avusturya) ile saptanmıştır. Standart dil�syonların absorbans değerleri ile uygulama grubu �rneklerinin absorbans değerleri kit i�eriğinde belirtildiği şekilde orantılanarak, pg/ml cinsinden sonu�lar elde edilmiştir. T�m deney grubu farelerinin dalaklarından (Stemcell NK Cell isolation kit, Stemcell, Catalog #19855) izolasyon kiti ile elde edilen NK h�crelerinin sitotoksik aktiviteleri ise Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, ABD) kullanılarak saptanmıştır. Bu deneyde hedef h�cre olarak YAC-1 (ATCC TIB-160) kullanılmıştır. Deneylerde hedef h�cre oranları 50 μl besiyerine 10.000 h�cre/kuyucuk ve efekt�r h�cre oranları 50 μl besiyerine 10/1'den 0.02/1 (efekt�r h�cre: hedef h�cre) olacak şekilde uygulanmıştır.

İstatistiksel değerlendirmeler; s�rekli değişkenler olan trofozoit sayıları, IL-2, IL-12 ve IFN- ve NK sitotoksisitesi değerlerinin normal dağılımına Shapiro-Wilk testiyle bakılmış, değişkenlerin normal dağıldığı g�r�lm�şt�r (p< 0.05). One Way (Tek Y�nl�) ANOVA testiyle parametrik olarak değerlendirilen gruplardan en az biri diğerlerinden farklı �ıkmıştır (p< 0.05). Gruplar arasında fark olduğunu belirlemek amacıyla Post Hoc ikili karşılaştırma testleri uygulanmıştır. Tek y�nl� ANOVA testlerinde yapılan homojenite incelemesinde varyansları homojen �ıkmayan (p< 0.05) parametreler trofozoit sayısı ve IL-2 grupları i�in Post Hoc testlerinden Tamhane's T2, varyansları homojen �ıkan (p> 0.05) parametreler IL-12 ve IFN- grupları i�in Poct Hoc testlerinden Tukey HSD kullanılmıştır. İstatistiksel anlamlılık p< 0.05 olarak kabul edilmiştir.

BULGULAR

AZT, CV ve AZT + CV gruplarındaki ortalama trofozoit sayılarının her biri SK grubu trofozoit sayılarına g�re anlamlı derecede d�ş�k olarak saptanmıştır (p< 0.001). AZT grubu trofozoit sayısı CV grubu trofozoit sayısına g�re anlamlı derecede d�ş�k, AZT + CV grubuna g�re ise anlamlı derecede y�ksek olarak saptanmıştır (p< 0.001). Tedavi gruplarının ortalama trofozoit sayılarıyla b�y�me inhibisyon aktiviteleri hesaplanmıştır. B�y�me inhibisyon aktivite form�l� kullanılarak yapılan hesaplamalarda AZT tedavi grubu %98.46; CVE grubu %88.6 ve AZT + CVE kombinasyon tedavi grubu %99.4 oranlarında EK grubuna g�re T.gondii'ye karşı antiprotozoal etki g�stermiştir (Tablo II).


Tablo II

NK h�crelerinin sitotoksik aktiviteleri EK grubunda SK grubuna oranla anlamlı d�zeyde y�ksek olarak saptanmıştır (p< 0.001). CV grubu değerleri SK, EK ve AZT grubuna g�re olduk�a y�ksek olarak saptanmıştır (p< 0.001). CV grubu değerleri CV + AZT grubundan da anlamlı olarak y�ksek saptanmıştır (p= 0.011). Yine CV + AZT grubu değerleri ise SK, EK ve AZT grubuna oranla anlamlı olarak y�ksek bulunmuştur (p< 0.001).

IL-12 miktarları EK ve CV gruplarında SK, AZT ve AZT + CV gruplarına g�re anlamlı derecede y�ksek bulunmuş (p< 0.001), CV ve EK grupları arasında ise anlamlı bir farklılık saptanmamıştır (p= 0.106). AZT grubu değerleri ise AZT + CV grubuna g�re anlamlı oranda y�ksek olarak saptanmıştır (p< 0.001). IFN- değerleri EK grubunda t�m diğer gruplara oranla anlamlı derecede y�ksek olarak saptanmıştır (p< 0.001). CV grubu değerleri ise SK, AZT ve AZT + CV gruplarına oranla y�ksek olarak bulunmuştur (p< 0.001). AZT grubu AZT + CV ve SK, AZT + CV grubunda ise SK gruba oranla IFN-seviyeleri y�ksek bulunmuştur (p< 0.001). IL-2 değerleri CV grubunda t�m gruplara oranla anlamlı derecede y�ksek bulunmuştur (p< 0.001). Değerler CV + AZT grubunda ise SK, EK ve AZT gruplarına oranla ve EK grubunda ise AZT ve SK grubuna g�re anlamlı �l��de y�ksek bulunmuştur (p< 0.001) (Tablo III).


Tablo III

TARTIŞMA

T.gondii t�m d�nyada yaygın, hamilelere bulaşmasıyla yenidoğanlarda, imm�n sistemi baskılanmış (İSB) hastalarda oluşturduğu �l�mc�l tablolar ve uzun tedavi s�releri gerektiren ok�ler toksoplazmoz gibi klinik tablolarla �nemli bir protozoondur. Standart tedavisinde kullanılan y�ksek toksik ajanların (primetamin-sulfonamid), toksisitesi d�ş�k antiparaziter ila�lar bulunması gerekliliğini doğurmuştur. Primetamin kemik iliğini baskılayabilmekte bu nedenle, İSB kişiler ve hamilelerde kullanımı �nerilmemektedir. Azitromisin toksisitesi d�ş�k bir ajandır. �zellikle İSB hastalarda, hamilelik d�neminde de kullanılabileceği bildirilmektedir12,13. Ayrıca TE'nin primer ve sekonder profilaksisinde kullanılabileceği bildirilmiştir14. HIV'li hastalarda ok�ler toksoplazmoz tedavisi, yan etkilerine rağmen, n�ks olasılığı nedeniyle hayat boyu devam edebilmektedir. Azitromisinin ok�ler toksoplazmoz olgularında �zellikle diğer tedavi se�eneklerinin uygulanamadığı hastalarda başka antiparaziter ila�larla birlikte kullanılabileceği belirtilmiştir15. �alışmamızda bu bilgileri destekler nitelikte; AZT grubu periton sıvılarındaki trofozoit sayıları EK grubuna oranla anlamlı derecede d�ş�k saptanmıştır (p< 0.001). Yine b�y�me inhibisyon aktivite form�l� kullanılarak yapılan hesaplamalarda AZT grubu %98.46 oranında EK grubuna g�re T.gondii'ye karşı antiprotozoal etki g�stermiştir.

Chlorella vulgaris, sıcak su ekstresi (CVE)'nin Escherichia coli peritoniti oluşturulan farelerde enfeksiyona karşı koruma sağladığı belirlenmiştir.16 Listeria monocytogenes ile enfekte edilen farelerde iki farklı dozda (50 ve 500 mg/kg/g�n) CV verilen farelerde kurtulma oranlarının arttığı (%20 ile %55, sırasıyla) belirlenmiştir8. Diğer bir �alışmada kurşun ile imm�ns�presyon sağlanan fareler L.monocytogenes ile enfekte edilmiş, CV'nin kurşunun neden olduğu imm�ns�presyonun olumsuz etkisini azaltarak farelerin kurtulma oranlarını arttırdığı bildirilmiştir.17

S�z konusu �alışmalara benzer olarak �alışmamızda; 500 mg/kg/g�n 6 g�n boyunca CV verilen grupta periton sıvılarındaki trofozoit sayıları EK grubuna oranla anlamlı derecede d�ş�k saptanmıştır. Ayrıca CV grubu %88.6 oranında EK grubuna g�re T.gondii'ye karşı antiprotozoal etki g�stermiştir. CV'in tek başına bile T.gondii enfeksiyonunda neden olduğunu gerileme, �zellikle infeksiyon a�ısından riskli bireylerde profilaktik olarak kullanılabileceğini d�ş�nd�rmektedir.

Azitromisinin diğer anti-paraziter ila�larla kombinasyon şeklinde kullanılmasının tedavi etkinliğini arttırdığı bildirilmiştir. Azitromisinin primetamin ile kombinasyonu 42 yetişkin HIV pozitif, TE tanısı alan hasta ile yapılan �alışmada kullanılmış, uygun bir alternatif tedavi se�eneği olduğu, sulfonamid ve klindamisini tolere edemeyen TE olgularında etkin şekilde kullanılabileceği bildirilmiştir14.

�alışmamızda AZT + CV grubu trofozoit sayıları EK, AZT ve CV gruplarına g�re anlamlı derecede d�ş�k olarak bulunmuştur. AZT + CV grubu %99.4 oranında EK grubuna g�re T.gondii'ye karşı antiprotozoal etki g�stermiştir. �alışmamızın sonu�ları, bir antimikrobiyal ajan olmamasına karşın CV'nin AZT ile kombinasyon tedavisinin enfeksiyonun gerilemesine �nemli �l��de katkıda bulunduğunu g�stermiştir.

T.gondii v�cuda girdiği zaman doğal ve edinsel bağışıklığa ait pek �ok h�crenin dahil olduğu bir yanıt oluşur. Akut toksoplazmozda erken d�nemde oluşan doğal bağışık yanıtta dendritik h�creler, n�trofiller ve makrofajlar parazit antijenlerine karşı IL-12, IFN- ve TNF-� �reterek direkt olarak yanıt verirler. Eğer parazit temizlenemezse imm�n s�re� �zg�l bağışık yanıt ile devam eder18-21.

�zg�l koruyucu bağışıklık T.gondii'nin h�cre i�i paraziti olması nedeni ile h�cre-aracılı bağışık yanıt şeklinde oluşur. T h�creleri tarafından �retilen IFN- konak yanıtının �nemli bir fakt�r�d�r ve T-lenfosit defektli hayvanlarda avirulan T.gondii suşlarının virulan hale geldiği bildirilmiştir22,23.

Makrofajlar ve dendritik h�crelerce �retilen IL-12 enfeksiyonun akut fazında savunmada ana rol� �stlenir. IL-12, NK h�creleri ve T lenfositlerden (CD4, CD8 T h�creleri) IFN- salınımını aktive eder. CD4, CD8 T h�creleri konağın T.gondii enfeksiyonuna diren�te rol oynar. CD8 h�crelerinin �oğalması ve NK h�crelerinin olgunlaşması ayrıca IFN- �retilmesini uyarır. TNF- ise monosit, makrofaj ve T lenfositlerince �retilir ve makrofaj aktivasyonu ve parazit replikasyonunun durdurulması i�in gereklidir24.

CV'nin enfeksiyonlarda imm�n sistemin d�zenlenmesine katkıda bulunarak koruyucu etki oluşturduğu belirlenmiştir. CV'nin oral uygulamasının L.monocytogenes'in subletal dozları ile enfekte farelerdeki NK h�creleri aktivitesi �zerindeki etkileri araştırılmış, enfeksiyonun tek başına NK h�cre aktivitelerinde bir artışa neden olduğu, CV uygulanan enfekte hayvanlarda NK h�cre aktivitelerinde ek bir artış g�zlemlendiği ve bu artışın enfekte gruplara oranla �nemli �l��de y�ksek olduğu vurgulanmıştır16. Yine L.monocytogenes ile enfekte, kurşun ile imm�n sistemi baskılanan farelerde, CV'nin kandaki kurşun d�zeyini azaltarak, ayrıca serum koloni-stimule eden fakt�r (GM-CSF) seviyelerini arttırarak kurşunun neden olduğu miyelos�presyonu �nlediği belirtilmiştir. Fakat bu koruyucu etkinin IFN- defektli farelerde g�r�lmediği, CV'nin koruyucu etkilerinin IFN- ile ilişkili olduğu �ne s�r�lm�şt�r17. L.monocytogenes ile enfekte farelerde CV'nin Th1 sitokinlerinin (IFN- ve IL-12) �retimini arttırdığı belirtilmiştir. Bir başka �alışmada CV'nin normal ve Murine Kazanılmış İmm�n Yetmezlik Sendromu (MAIDS) olan farelerde L.monocytogenes ile enfekte farelerde IFN-, IL-2, IL-1ve TNF- d�zeylerini arttırdığı bildirilmiştir25. CV'nin antiviral etkinliği de olduğu, ayrıca CV'nin NK h�crelerinin aktivitelerinde ve IFN- �retiminde artışa neden olarak sitomegalovir�s replikasyonunu �nlediği g�sterilmiştir.26

�alışmamızda NK h�crelerinin sitotoksik aktiviteleri CV grubunda, SK, EK ve AZT ve CV + AZT grubundan anlamlı olarak y�ksek saptanmıştır. Yine CV + AZT grubu ise SK, EK ve AZT grubuna oranla anlamlı olarak y�ksek bulunmuştur. Bu sonu�lar CV'nin NK h�crelerinin sitotoksisitelerini arttırdığını g�stermektedir. EK grubu NK sitotoksisite değerlerinin hi�bir enfeksiyonun olmadığı SK grubuna oranla anlamlı d�zeyde y�ksek olması enfeksiyonun NK h�cre sitotoksisitelerinde bir artışa neden olduğunu g�stermektedir. Bu sonu�lar literat�rde CV'in L.monocytogenes ile enfekte farelerde NK sitotoksisitesini arttırdığını �ne s�ren �alışmaya benzerdir16. CV grubunun CV + AZT grubuna oranla daha y�ksek sitotoksik aktivite g�stermesi, CV + AZT grubundaki farelerde T.gondii'nin neredeyse tamamen elimine olmasından kaynaklandığını d�ş�nd�rm�şt�r.

�alışmamızda EK ve CV gruplarının IL-12 değerleri SK, AZT ve AZT + CV gruplarına g�re anlamlı derecede y�ksek bulunmuş, CV ve EK grupları arasında ise anlamlı bir farklılık saptanmamıştır. Sadece T.gondii ile enfekte edilen EK grubunda IL-12 değerlerinin hi�bir enfeksiyonun olmadığı SK grubuna g�re anlamlı d�zeyde y�ksek olması enfeksiyonun IL-12 seviyelerinde bir artışa neden olduğunu g�stermektedir. CV grubunda EK grubuna g�re enfeksiyon anlamlı derecede gerilemiş olmasına rağmen IL-12 değerleri arasında az bir fark olması CV uygulanmasının IL-12'yi arttığını destekler niteliktedir. Yine AZT + CV grubunda AZT grubuna oranla d�ş�k IL-12 d�zeylerinin saptanması ise yine AZT + CV grubunda enfeksiyonun anlamlı �l��de elimine olmasından kaynaklandığını d�ş�nd�rm�şt�r.

�alışmamızda gruplara ait IFN- seviyeleri IL-12 d�zeylerine benzer bulunmuştur. En y�ksek IL-12 d�zeylerinin EK grubunda olması, bunu sırasıyla CV, AZT ve AZT + CV, SK gruplarının izlemesi enfeksiyonun şiddetinin azalması ile uyum g�stermektedir.

Sitokinlerin uzamış etkileri, y�ksek biyolojik potansiyelleri nedeniyle hasara sebep olur27. S�nmez ve arkadaşları28 2014 yılındaki toksoplazmoz tedavisinde atovakuon ve astragalus kombinasyonunun etkinliğini araştırdıkları �alışmalarında bu kombinasyonun uygulandığı grupta IL-12 d�zeylerinin d�ş�k bulunmasını enfeksiyonun azalması ile ilişkilendirmiş ve bu durumun imm�n sistemdeki inhibisyon/aktivasyon dengesinin işleyişinin d�zg�n �alıştığını doğruladığını bildirmişlerdir. Bizim �alışmamızda da enfeksiyon şiddetinin azalması ile IL-12 ve IFN- d�zeylerinde d�ş�ş meydana gelmiştir.

IL-2, T lenfositlerin proliferasyonu ile doğrudan ilişkili bir sitokindir. �alışmamızda CV grubunda IL-2 d�zeyi en y�ksek olup, bunu CV + AZT grubu takip etmiştir. Bu sonu� CV'nin IL-2 d�zeylerinde anlamlı bir y�kselişe neden olduğunu g�stermektedir. CV + AZT grubunda CV'ye oranla anlamlı bir d�ş�ş g�zlenmiştir. Bu durum yine enfeksiyonun iyileşme oranının daha y�ksek olması ile ilişkilendirilebilir. AZT grubunda ise CV grubuna g�re anlamlı oranda d�ş�k fakat enfeksiyonun iyileşme oranın daha fazla olduğu g�z �n�ne alınırsa CV'nin IL-2 d�zeylerinde olduk�a fazla bir artışa neden olduğu g�ze �arpmaktadır. Bu bulgular deneysel olarak kanser oluşturulan farelerden CV uygulanan grupta kontrol grubununa oranla anlamlı bir artış g�r�ld�ğ�n� belirten �alışma ile benzerdir.29

Sonu� olarak; T.gondii g�n�m�zde �nemini koruyan bir protozoondur. �alışmamızda azitromisinin bir imm�nomod�lat�r olan CV ile birlikte uygulanması T.gondii eliminasyonunda y�ksek başarı g�stermiştir. CV'nin İSB farelerde imm�n yanıtı d�zenleyici etkisinin bildirilmiş olması TE gibi ciddi toksoplazmoz komplikasyonları y�n�nden risk taşıyan bireylerde CV ile AZT kombinasyon tedavisinin etkin olarak uygulanabileceğini d�ş�nd�rmektedir. �alışmamızda CV'nin tek başına uygulanması bile enfeksiyonda y�ksek oranlarda gerilemeye neden olmuş, bu sonu� toksoplazmoz y�n�nden risk taşıyan imm�n sistemi baskılanmış bireylerde profilakside kullanılabileceğini akla getirmiştir. Sonu�larımız CV'nin toksoplazmoz tedavisinde kullanımı ile ilgili daha ileri �alışmalara gerek olduğununu d�ş�nd�rm�şt�r.

TEŞEKK�R

2211-C Yurt İ�i Doktora Burs Programı kapsamında sağladığı destek nedeniyle T�BİTAK Bilim İnsanı Destekleme Daire Başkanlığı birimine ve ayrıca İstanbul �niversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi (Proje No: 45031)'ne teşekk�r ederiz. Ayrıca projenin h�cre k�lt�r� aşamasındaki yardımları i�in İstanbul Tıp Fak�ltesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı'ndan Prof.Dr. Seyhun �OLAKOĞLU ve Sibel DOĞAN'a, istatistiksel hesaplamalardaki yardımlarından dolayı ise İstanbul Tıp Fak�ltesi Halk Sağlığı Anabilim Dalı'ndan Prof. Dr. Halim İŞSEVER'e teşekk�r ederiz.

KAYNAKLAR

  1. Walker W, Roberts CW, Ferguson DJ, Jebbari J, Alexander J. Innate immunity to Toxoplasma gondii is influenced by gender and is associated with differences in IL-12 and gamma interferon production. Infect Immun 1997; 65(3): 1119-21.
  2. Gutierrez Y. Diagnostic pathology of parasitic infections with clinical correlations. pp: 201-34. Oxford University Press Inc. 2000, 2nd� ed. New York.
  3. Mehlhom H. Encyclopedic reference of parasitology. Chapter 2519: Toxoplasma gondii. 2016; 2766-72.
  4. G�r�z AY, �zcel MA. Toxoplasmosis. pp: 141-89. �zcel'in tıbbi parazit hastalıkları. In: M. Ali �zcel (ed). 2007, Meta Basım. Bornova, İzmir.
  5. Suzuki Y, Conly PK, Remington JS. Importance endoeneous INF-gamma for prevention of toxoplasmic encephalitis in mice. J Immunol 1989; 143(6): 2045-50.
  6. Araujo FG, Guptill DR, Remigton JS. Azithromycin, a macrolide antibiotic with potent activity against Toxoplasma gondii. Antimicrob Agents Chemother 1988; 32(5): 755-7.
  7. Kwak JH, Baek SH, Woo Y, et al. Beneficial immunostimulatory effect of short-term Chlorella supplementation: enchancement of naturel killer cell activity and early inflammatory response (Randomized, doubleblinded, placebo-controlledtrial). Nutr J 2012; 11: 53.
  8. Dantas DCM, Kaneno R, Queiroz MLS. The effects of Chlorella vulgaris in the protection of mice infected with Listeria monocytogenes, role of naturel killer cells. Immunopharmacol� Immunotoxicol 1999; 21(3): 609-19.
  9. Degerli K, Kilimcioglu AA, Kurt �, Tamay AT, �zbilgin A. Efficacy of azithromycin in a murine toxoplasmosis model, employing a Toxoplasma gondii strain from Turkey. Acta Tropica 2003; 88(1): 45-50.
  10. B�y�kbaba Boral O, S�nmez Tamer G, Ke�eli �zcan S, S�nmez N, Işsever H, Tekeli F. Investigation of combined effectiveness of spiramycin and beta-glucan in mice models of acute toxoplasmosis and determination of IL-10, IL-12 and TNF- levels. Mikrobiyol Bul 2012; 46(3): 446-55.
  11. Muelas-Serrana S, Nagal JJ, Martinez-Diaz RA, Escario JA, Mart�nez-Fern�ndez AR, G�mez-Barrio A. In vitro Screening of American plant extracts on Trypanasoma cruzi and Trichomonas vaginalis 2. J Ethnopharmacol 2000; 71(1-2): 101-7.
  12. Bahat Dinur A, Koren G, Matok I, et al. Fetal safety of macrolides. Antimicrob Agents Chemother 2013; 57(7): 3307-11.
  13. Beckers CJ, Roos DS, Donald RG, et al. Inhibition of cytoplasmic and organellar protein synthesis in Toxoplasma gondii Implications for the target of macrolide antibiotics. J Clin Invest 1995(1); 95: 367-76.
  14. Jacobson JM, Hafner R, Remington J, et al. Dose-escalation, phase I/II study of azithromycin and pyrimethamine for the treatment of toxoplasmic encephalitis in AIDS. AIDS� 2001; 15(5):583-9.
  15. Rothova A, Bosch-Driessen LEH, Loon NHW, Treffers WF. Azithromycin for ocular toxoplasmosis. Br J Ophthalmol 1998; 82(11): 1306-8.
  16. Tanaka K, Koga T, Konishi F, et al. Augmentation of host defense by a unicellular green alga, Chlorella vulgaris, to Escherichia coli infection. Infect Immun 1986; 53(2): 267-71.
  17. Queiroz MLS, Rodrigues APO, Bincoletto C, Figueiredo CAV, Malacrida S. Protective effects of Chlorella vulgaris in lead-exposed mice infected with Listeria monocytogenes. Int Immunopharmacol 2003; 3(6): 889-900.
  18. Fillisetti D, Candolfi E. Immun response to Toxoplasma gondii. Ann Ist Super Sanita 2004; 40(1): 71-80.
  19. Scharton-Kersten TM, Wynn TA, Denkers EY, et al. In the absence of endogenous IFN-gamma, mice develop unimpaired IL-12 responses to Toxoplasma gondii while failing to control acute infection. J Immunol 1996; 157(9): 4045-54.
  20. Johnson LA. Protective role for endogenous tumor necrosis factor in Toxoplasma gondii infection. Infect Immun 1992; 60(5):1979-83.
  21. Denkers EY, Gazinelli RT. Regulation and function of T-cell-mediated immunity during Toxoplasma gondii infection. Clin Microbiol Rev 1998; 11(4): 569-88.
  22. Gazinelli RT, Hieny S, Wynn TA, Wolf S, Sher A. Interleukin-12 is required for T lymphocyte independent induction induction of interferon gamma by an intracellular parasite and induces resistance in T cell-deficient hosts. Proc Natl Acad Sci 1993; 90(13): 6115-9.
  23. Lindberg RE, Frenkel JK. Toxoplasmosis in nude mice. J Parasitol 1977; 63(2): 219-21.
  24. Buzoni-Gatel D, Werts C. Trends Toxoplasma gondii and subversion of the immune system. Trends Parasitol 2006; 22(10): 448-52.
  25. Hasegawa T, Kimura Y, Hiromatsu K, et al. Effect of hot water extract of Chlorella vulgaris on cytokine expression patterns in mice with murine acquired immunodeficiency syndrome after infection with Listeria monocytogenes. Immunopharmacology 1997; 35(3): 273-82.
  26. Ibusuki K, Minamishima Y. Effect of Chlorella vulgaris extracts on murine Cytomegalovirus infections. Nat Immun Cell Growth Regul 1990; 9(2): 121-8.
  27. Yılmaz �, Turgay N. Sitokin ilişkili h�cre i�i sinyal iletimi ve paraziter enfeksiyonlardaki �nemi. T�rk Parazitol Derg 2009; 33(4): 301-6.
  28. S�nmez N, B�y�kbaba Boral O, Kaşali K, Tekeli F. Effects of atovaquone and astragalus combination on the treatment and IL-2, IL-12, IFN- levels on mouse models of acute toxoplasmosis. Mikrobiyol Bul 2014; 48(4): 639-51.
  29. Ramos AL, Torello CO, Queiroz ML. Chlorella vulgaris modulates immunomyelopoietic activity and enhances the resistance of tumor-bearing mice. Nutr Cancer 2010; 62(8): 1170-80.

İletişim (Correspondence):

Uzm. Dr. Deniz G�k�e �elik,

İstanbul �niversitesi İstanbul Tıp Fak�ltesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

34093, Fatih, �apa, İstanbul, T�rkiye.

Tel (Phone): +90 212 414 2000-31399,

E-posta (E-mail): denizgozdecelik@gmail.com

Yazdır