Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2016; 50(4): 522-534

Bir �niversite Hastanesinde İzole Edilen �ok İlaca Diren�li Acinetobacter baumannii İzolatlarının
Antimikrobiyal Duyarlılığı ve Molek�ler Karakterizasyonu

Antimicrobial Susceptibility and Molecular Characterization of Multidrug-Resistant
Acinetobacter baumannii Isolated in an University Hospital

Şahin DİREKEL1, Ayşeg�l �OPUR �İ�EK2, Alper KARAG�Z3, Nebahat AYDOĞAN EJDER2, Efdal OKTAY4,
Nuran DELİALİOĞLU4, Osman Birol �ZG�M�Ş2, Rıza DURMAZ3,6

1 Giresun �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Giresun.

1 Giresun University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Giresun, Turkey.

2 Recep Tayyip Erdoğan �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Rize

2 Recep Tayyip Erdoğan University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Rize, Turkey.

3 T�rkiye Halk Sağlığı Kurumu, Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarları B�l�m�, Molek�ler Mikrobiyoloji Araştırma ve

Uygulama Laboratuvarı, Ankara.

3 Public Health Agency of Turkey, Department of Microbiology Reference Laboratories, Molecular Microbiology Research and

Application Laboratory, Ankara, Turkey.

4 Mersin University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Mersin, Turkey.

4 Mersin University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Mersin, Turkey.

5 Recep Tayyip Erdoğan �niversitesi, Fen Edebiyat Fak�ltesi Biyoloji B�l�m�, Rize.

5 Recep Tayyip Erdoğan University Faculty of Arts and Sciences, Biology Department, Rize, Turkey.

6 Yıldırım Beyazıt �niversitesi Tıp Fak�ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.

6 Yıldırım Beyazit University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

�Z

Aerobik, hareketsiz, gram-negatif bir bakteri olan Acinetobacter baumannii, bir�ok antibiyotiğe diren� g�steren �nemli bir nozokomiyal patojendir. Karbapenemler, bu patojenin neden olduğu enfeksiyonların tedavisi i�in en yaygın kullanılan antibiyotiklerdendir. Ancak son yıllarda A.baumannii'de karbapenem direncinin giderek artan oranlarda saptanması, tedavide ciddi problemlere yol a�maktadır. Bu �alışmanın amacı, klinik A.baumannii izolatlarının antibiyotik duyarlılık profillerinin saptanması, blaOXA diren� genlerinin varlığının araştırılması ve izolatlar arasındaki klonal ilişkinin belirlenmesidir. �alışmaya, Mayıs 2012-Ocak 2013 tarihleri arasında Mersin �niversitesi Tıp Fak�ltesi Hastanesi'ne başvuran hastaların �eşitli klinik �rneklerinden (37 solunum yolu �rneği, 11 yara, 10 kan, 8 kateter, 6 doku, 5 idrar, 2 apse) izole edilen 79 A.baumannii suşu dahil edilmiştir. İzolatlar konvansiyonel y�ntemler ve Vitek�2 Compact otomatize sistemi ile tanımlanmıştır. İzolatların antibiyotik duyarlılıkları Kirby-Bauer disk dif�zyon y�ntemiyle araştırılmış ve CLSI kriterlerine g�re değerlendirilmiştir.� Suşlarda blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-48 ve blaOXA-58 genlerinin varlığı in-house polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile araştırılmış; suşlar arasındaki klonal ilişki, ApaI restriksiyon enziminin kullanıldığı değişken alanlı (pulse-field) jel elektroforezi (PFGE) ile belirlenmiştir. �alışmamızda, t�m izolatların kolistine duyarlı olduğu g�r�lm�ş; piperasilin/tazobaktam, siprofloksasin, imipenem, meropenem, sefaperazon/s�lbaktam, trimetoprim/s�lfametoksazol, seftazidim, levofloksasin, gentamisin, tetrasiklin, ampisilin/s�lbaktam, amikasin, netilmisin ve tigesikline diren� oranları sırasıyla; %97.5, %96.2, %94.9, %94.9, %93.6, %91.1, %88.6, %86, %83.6, %77.2, %69.6, %55.7, %27.8 ve %3.8 olarak saptanmıştır. T�m suşlar, OXA'ya �zg�l PCR ve OXA16S rDNA dizi analizi ile A.baumannii olarak tanımlanmıştır. İzolatların t�m�nde (%100) blaOXA-51, 71'inde (%89.9) ise blaOXA-23 gen varlığı saptanmış; hi� bir izolatta blaOXA-24, blaOXA-48 ve blaOXA-58 genleri tespit edilmemiştir. PFGE sonu�larına g�re 10 pulsotip tanımlanmış; bunlardan sekizinde 3-30 arasında değişen, birbirinden ayırt edilemeyen benzer PFGE profilleri g�steren 77 (%97.5) izolatın [A (n= 30), B (n= 20), C (n= 9), D (n= 5), E (n= 4), F (n= 3), G (n= 3), H (n= 3)] bulunduğu belirlenmiştir. Klon A ve B'nin, diğer klonlarla karşılaştırıldığında hasta �rneklerinde baskın olduğu ve antibiyotiklere direncin y�ksek seviyelerde olduğu g�r�lm�şt�r. Geriye kalan iki pulsotip [I (n= 1), J (n= 1)] ana k�me ile yakın ilişkili olarak bulunmuştur. Ortak bir salgın izolatı saptanmamış; ancak b�y�k kısmının klonal olarak ilişkili olduğu ve hastanemizde �apraz kontaminasyon sorununun yaşandığı belirlenmiştir. Sonu� olarak �alışmamızda, klinik A.baumannii suşlarında karbapenem direncinden sorumlu başlıca genlerin blaOXA-51 ve blaOXA-23 olduğu izlenmiş; A ve B klonlarının y�ksek prevalansa sahip olmasının yatan hastalar a�ısından tehlike oluşturabileceği d�ş�n�lm�şt�r.

Anahtar s�zc�kler: Acinetobacter baumannii; değişken alanlı jel elektroforezi; OXA tipi karbapenemazlar; molek�ler epidemiyoloji.

ABSTRACT

Acinetobacter baumannii, an aerobic, non-motile, gram-negative bacterium is an important nosocomial pathogen which shows resistance to the most antibiotics. Carbapenems are the most commonly used antibiotics for the treatment of infections caused by this pathogen. However the emergence of resistance against carbapenems in an increasing rate generates serious problems for antimicrobial therapy. The aims of this study were to detect the antibiotic susceptibility, and the presence of blaOXA resistance genes of clinical A.baumannii� isolates and to determine the clonal relationship between these isolates. A total of 79 A.baumannii strains isolated from various clinical specimens (37 respiratory tract samples, 11 wound, 10 blood, 8 catheters, 6 tissue, 5 urine, 2 abscess) of the patients admitted to Mersin University Medical School Hospital between May 2012-January 2013, were included in the study. The isolates were identified by conventional methods and Vitek�2 Compact automated system. Antibiotic susceptibilities of the isolates were determined by Kirby-Bauer disk diffusion method and evaluated according to CLSI criteria. The presence of blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-48 and blaOXA-58 genes were detected by an in-house polymerase chain reaction (PCR), and the clonal relationship between the isolates were identified by pulsed-field gel electroforesis (PFGE) using the ApaI restriction enzyme. In our study, all of the isolates were susceptible to colistin, while the resistance rates against piperacillin-tazobactam, ciprofloxacin, imipenem, meropenem, cefoperazone/sulbactam, trimethoprim-sulfamethoxazole, ceftazidime, levofloxacin, gentamicin, tetracycline, ampicillin-sulbactam, amikacin, netilmicin and tigecycline were 97.5%, 96.2%, 94.9%, 94.9%, 93.6%, 91.1%, 88.6%, 86%, 83.6%, 77.2%, 69.6%, 55.7%, 27.8% and 3.8%, respectively. All the isolates were identified as A.baumannii with the OXA-specific PCR and OXA16S rDNA sequence analysis. All of the isolates (100%) harboured blaOXA-51� and 71 (89.9%) harboured blaOXA-23 gene, however they were all negative for blaOXA-24, blaOXA-48 and blaOXA-58 genes. According to PFGE results 10 pulsotypes were identified, of these eight pulsotypes formed 77 (97.5%) similar strains with indistinguishable PFGE profiles ranging between 3-30 [A (n= 30), B (n= 20), C (n= 9), D (n= 5), E (n= 4), F (n= 3), G (n= 3), H (n= 3)]. When compared with the other clones, clones A and B were dominant among the samples and they have exhibited high level of antibiotic resistance. The rest two pulsotypes [I (n= 1), J (n= 1)] were in close relation with the main cluster. No common outbreak isolate was detected, but the relationship between the majority of the strains pointed out that there was a cross contamination problem in our hospital. In conclusion blaOXA-51 and blaOXA-23 were detected as predominant genes responsible from carbapenem resistance in our clinical A.baumannii strains, and it was considered that the high prevalence of clones A and B may constitute a threat in terms of hospitalized patients.

Keywords: Acinetobacter baumannii; pulsed-field gel electroforesis; OXA-type carbapenemases; molecular epidemiology.

Geliş Tarihi (Received): 25.03.2016 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 21.10.2016

GİRİŞ

Acinetobacter baumannii aerobik, hareketsiz, gram-negatif, non-fermentatif, pleomorfik bir kokobasildir. Hastane ortamında g�nlerce canlı kalabilen bu bakteri, bir hastadan diğerine kolayca yayılabilir1-4. A.baumannii, �zellikle yoğun bakım �niteleri (YB�)'nde ve imm�n sistemi bozulmuş hastalarda; ventilat�r ile ilişkili pn�moni, �riner sistem enfeksiyonu, yumuşak doku ve yara yeri enfeksiyonu, peritonit, endokardit, sepsis ve menenjit gibi olduk�a ciddi hastane enfeksiyonlarına neden olabilmektedir. Solunum sistemi ekipmanları gibi nemli, insan cildi gibi kuru y�zeylerde uzun s�re canlılığını koruyabilme, hastane ortamında kolayca yayılabilme ve antimikrobiyal ila�lara karşı diren� geliştirebilme yeteneği nedeniyle, bu bakterinin oluşturduğu enfeksiyonlar b�y�k bir sorun oluşturmaktadır. A.baumannii'ye bağlı mortalite oranları, �zellikle ventilat�r ile ilişkili pn�moni (%23-73) ve kan dolaşımı enfeksiyonu (%52) olan kritik hastalarda olduk�a y�ksektir2,4-7. �nemli bir nozokomiyal enfeksiyon etkeni olan A.baumannii, hastanede yatan pn�monili hastalardan izole edilen ���nc� en yaygın patojen bakteridir8. Travma, mekanik ventilasyon, imm�n s�presyon, cerrahi işlemler, intraven�z kateterizasyon, trakeostomi, enteral beslenme ve ���nc� kuşak sefalosporin, florokinolon veya karbapenem gibi antibiyotiklerin kullanımı A.baumannii enfeksiyonları i�in maj�r risk fakt�rleridir3.

Acinetobacter t�rleri arasında karbapenem direncinin son dekatta artış g�stermesi d�nya genelinde b�y�k bir problem oluşturmaktadır9. A.baumannii'de antimikrobiyal diren� mekanizmalarını tanımlamak bu mikroorganizmanın neden olduğu enfeksiyonun sonu�larının anlaşılmasına katkı sağlayacaktır4. A.baumannii'de diren� mekanizması enzimin �retimi veya aktivasyonu, integron yapımı, dış membran ge�irgenliği, biyofilm oluşumu, ila� atım pompaları gibi fakt�rlere bağlı olarak karmaşıklık g�stermektedir4. A.baumannii'de karbapenem direncinin en �nemli nedeni; sınıf A (TEM, SHV ve GES), sınıf B (IMP, VIM ve SIM), sınıf C (AmpC) ve sınıf D'yi (OXA-23, OXA-24, OXA-51 ve OXA-58) i�eren karbapenem hidrolize eden beta-laktamaz ile ilişkili enzimatik hidrolizdir4. Antimikrobiyal kemoterapinin, �zellikle karbapenemlerin aşırı kullanımı; A.baumannii'de tanımlanmış olan karbapenemi hidrolize eden sınıf D beta-laktamazların (KHDL) g�r�lmesine katkıda bulunmuştur. İlk kez 1995'de tanımlanan KHDL olan OXA-51'e ek olarak, A.baumannii suşlarında OXA-23, OXA-40, OXA-58 ve OXA-143 beta-laktamaz gruplarını i�eren kazanılmış KHDL'ların alt grupları tanımlanmıştır10. blaOXA-58 geni t�m d�nyada tanımlanmasına karşın, Fransa, İngiltere, Arjantin, İspanya, Romanya, Avusturya, Yunanistan, İsko�ya, Kuveyt ve T�rkiye'de daha sık bildirilmiştir9.� 2012 CHINET s�rveyans raporuna g�re, A.baumannii suşlarında imipenem ve meropeneme karşı sırasıyla, %62.8 ve %59.4 olan diren� oranlarının %89.6 oranlarına �ıktığı belirtilmektedir4. Karbapeneme diren�li A.baumannii prevalansının Ortadoğu �lkelerinde y�ksek olduğu ifade edilmektedir11. A.baumannii'de OXA karbapenamaz geninin ekspresyonunda ISAba1 gen b�lgesinin �nemli rol� olduğu bildirilmiştir. �lkemizin de i�erisinde yer aldığı grupta, kromozom ve plazmid �zerinde kodlanan karbapenamaz direncinde, bu gen b�lgesine, ISAba2 ve ISAba3 gen b�lgelerinin de eşlik ettiği vurgulanmıştır9.

D�nya genelinde A.baumannii enfeksiyonlarının hastanelerde artış g�stermesine bağlı olarak, enfeksiyon kontrol �alışmaları ve epidemiyolojik �alışmalarda uygun molek�ler y�ntemlerin geliştirilmesi zorunluluk haline gelmiştir12. Kullanılan y�ntemler arasında; ribotiplendirme, AFLP (amplified fragment length polymorphism), RAPD (random amplified polymorphic DNA) analizi, rep-PCR (repetitive extragenic palindromic sequence-based polymerase chain reaction) ve multilokus PCR gibi bir�ok y�ntem bulunmasına karşın, bakteriyel izolatların tiplendirilmesi i�in değişken alanlı (pulsed-field) jel elektroforezi (PFGE) halen altın standart olarak kabul edilmektedir12. Bu �alışmada, A.baumannii suşlarının antimikrobiyal ila�lara duyarlılık paternlerinin belirlenmesi ve blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-48, blaOXA-51 ve blaOXA-58 gen varlığının PCR ile saptanması ama�lanmıştır. Ayrıca, t�m izolatlar i�in PFGE tiplendirme y�ntemi ile genetik profillerinin belirlenerek, izolatların genotipleri ile antimikrobiyal duyarlılıkları arasındaki genetik ilişkinin ve en yaygın klonun belirlenmesi hedeflenmiştir.

GERE� ve Y�NTEM

Bakteri izolatlarının tanımlanması

�alışmaya, Mayıs 2012 ile Ocak 2013 tarihleri arasında Mersin �niversitesi Tıp Fak�ltesi Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı'nda �eşitli klinik �rneklerden izole edilen ve enfeksiyon etkeni olan A.baumannii izolatları alındı. Klinik �rnekler %5 kanlı agar ve EMB (Eosin Methylene Blue) agara ekilerek 37�C'de 18-24 saat ink�be edildi. K�lt�rde �reyen bakterilerin t�r d�zeyinde tanımlanması, geleneksel y�ntemler (Gram boyama, oksidaz testi, sitrat testi, şeker kullanım testi, indol testi, �reaz testi) ve Vitek 2 (Bio-M�rieux, Fransa) otomatize sistemiyle �retici firmaların �nerileri doğrultusunda yapıldı. İzolatlar %10 gliserol i�eren beyin kalp inf�zyon buyyon� (BKIB) i�erisinde saklandı. �alışmaya, aynı hastadan izole edilen izolatlardan yalnızca biri alındı.

Farklı servislerden laboratuvarımıza g�nderilen toplam 79 klinik izolatın servislere ve �rnek t�r�ne g�re dağılımı Tablo I'de g�sterildi.


Tablo I

Antibiyotik Duyarlılık Testleri

Klinik izolatların in vitro antibiyotik duyarlılık testleri Kirby-Bauer disk dif�zyon y�ntemi ile Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)13 �nerileri doğrultusunda; gentamisin (10 μg), amikasin (30 μg), levofloksasin (5 μg), netilmisin (30 μg), seftazidim (30 μg), imipenem (10 μg), meropenem (10 μg), siprofloksasin (5 μg), tetrasiklin (30 μg), trimetoprim/s�lfametoksazol (30 μg), piperasilin (100 μg), ampisilin/s�lbaktam (20/10 �g), piperasilin/tazobaktam (100/10 �g) ve sefoperazon/s�lbaktam (75/30 �g) antibiyotikleri (Oxoid, Thermo Scientific, İngiltere) i�in test edildi. Kolistin ve tigesiklin duyarlılıkları ise Etest (BioMerieux, Fransa) y�ntemiyle incelendi. Standart kalite kontrol suşu olarak Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 kullanıldı. Tigesiklin E test minimal inhibit�r konsantrasyon (MİK) değeri "Food and Drug Administration (FDA)"14 �nerileri doğrultusunda; MİK değeri ≥ 8 �g/ml ise diren�li, 4-6 �g/ml ise orta duyarlı, ≤ 2 �g/ml ise duyarlı olarak değerlendirildi. Kolistin i�in Etest MİK değeri CLSI 2012 yorumlama kriterlerine g�re; ≥ 4 �g/ml ise diren�li, ≤ 2 �g/ml ise duyarlı olarak kabul edildi13.

Multipleks PCR ile ila� diren� genlerinin (blaOXA genleri) saptanması

Gliseroll� BKIB i�erisinde -80�C de saklanmış olan A.baumannii izolatları molek�ler �alışmalar i�in kanlı agar ve EMB agara pasajlanıp 37�C'de 18-24 saat ink�be edilerek tekrar �retildi. �reyen tek bir koloniden alınarak Luria Broth besiyerinde 37�C'de bir gece ink�basyona bırakıldı; daha sonra bakteri s�spansiyonu 13.000 rpm'de 5 dakika santrif�j edildi; s�pernatan atıldıktan sonra peletin �zerine 300 μl steril distile su eklendi; 10 dakika kaynatıldı, sonra tekrar 13.000 rpm'de 20 dakika santrif�j edildi. S�pernatan yeni bir t�pe aktarıldı ve ekstrakte edilmiş DNA olarak kullanıldı. PCR taramaları karbapenamaz kodlayan genler i�in yapıldı. Multipleks PCR, blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-48 ve blaOXA-58 genlerinin tespiti amacıyla uygulandı. OXA genlerinin amplifikasyonu i�in kullanılan primer �iftleri Tablo II'de g�sterildi. Toplam 50 μL'lik multipleks PCR karışımı; Taq DNA polimeraz 1.5 U (Promega), her bir dNTP'den 200 μM, 25mM MgCl2'den 3 μL, PCR reaksiyon tamponu 10 μL (Promega), her bir primerden 20 pmol ve 5 μL genomik DNA i�eriyordu. PCR amplifikasyon koşulları; başlangı� denat�rasyonu 94�C'de 3 dakika bir d�ng�, 94�C'de 25 sn, 52�C'de 40 sn ve 72�C'de 50 sn olmak �zere 30 d�ng� ve 72�C'de 5 dakika son uzama şeklinde ger�ekleştirildi. Amplifikasyon �r�nleri 0.5 mg/L etidyum brom�r i�eren %1'lik agaroz jelde 100 Voltta bir saat y�r�t�ld�kten sonra agaroz jel UV ışığı altında değerlendirildi.


Tablo II

PFGE ile molek�ler tiplendirme

A.baumannii izolatları arasındaki klonal ilişki; daha �nce Durmaz ve arkadaşlarının15 k���k modifikasyonlar yaparak tanımladıkları protokole g�re, agaroza g�m�lm�ş bakteriyal DNA ApaI restriksiyon endon�klez enzimiyle kesilerek PFGE y�ntemiyle analiz edildi. Jelin normalizasyonu i�in A.baumannii ATCC 19606 standart suşu kullanıldı. PFGE sonrası bant profillerinin dendogram analizleri, Bionumerics Gel Compare II (Applied Maths, Inc., 6.01 version, Bel�ika) programı kullanılarak yapıldı. Benzerliklerin hesaplanmasında Dice benzerlik katsayısı ile %1 tolerans değerleri kullanılarak dendogram oluşturuldu ve k�melenme analizi yapıldı. Klonal ilişki, Tenover ve arkadaşlarının16 �nerdikleri kriterlere g�re değerlendirildi. Analizde %90-100 uyum g�steren izolatlar aynı; %80-90 arası uyum g�sterenler yakın ilişkili; %70-80 arası uyum g�sterenler muhtemel ilişkili ve %70'in altında uyum g�sterenler ise ilişkisiz olarak kabul edildi.

İstatistiksel Analiz

İstatistiksel analizler Stata (versiyon 11.0) kullanılarak yapıldı. S�rekli değişken, varyansın tek y�nl� analizi ile karşılaştırıldı. Değişkenlerin analizi ki-kare testi ile yapıldı ve t�m analizler i�in p< 0.005 değeri anlamlı olarak kabul edildi.

BULGULAR

�alışmamızda değerlendirilen toplam 79 A.baumannii izolatının antibiyotik duyarlılık sonu�ları incelendiğinde, t�m izolatların kolistine duyarlı olduğu izlenmiş; piperasilin/tazobaktam, siprofloksasin, imipenem, meropenem, sefaperazon/s�lbaktam ve trimetoprim/s�lfametoksazole %91.1 ile %97.5 arasında; seftazidim, levofloksasin ve gentamisine %83.6 ile %88.6 arasında; tetrasiklin, ampisilin/s�lbaktam ve amikasine %55.7 ile %77.2 arasında diren� oranları saptanırken, netilmisine %27.8, tigesikline ise %3.8 oranında diren� bulunmuştur (Tablo III). Bu sonu�lar, imipenem ve meropenemin yer aldığı karbapenemlere karşı %94.9 gibi y�ksek d�zeyde diren� olduğunu g�stermektedir.


Tablo III

T�m izolatlar, 16S rRNA gen varlığının doğrulanmasıyla A.baumannii olarak tanımlanmıştır. T�m izolatlarda blaOXA-51 gen b�lgesi pozitif tespit edilirken, blaOXA-23 izolatların 71'inde (%89.9) pozitif bulunmuştur. blaOXA-58, blaOXA-48 ve blaOXA-24 gen b�lgeleri hi�bir izolatta tespit edilmemiştir (Tablo III, Şekil 1).


Şekil 1

Molek�ler tiplendirme sonu�larına g�re, ApaI restriksiyon enzimi kullanılarak yapılan PFGE'de 79 izolat değerlendirildiğinde 10 pulsotip tespit edilmiştir. Bunlardan 8 pulsotipte 3-30 arasında değişen, birbirinden ayırt edilemeyen benzer PFGE profilleri g�steren 77 (%97.5) izolat [A (n= 30), B (n= 20), C (n= 9), D (n= 5), E (n= 4), F (n= 3), G (n= 3), H (n= 3)] bulunmaktadır. Klon A ve B'nin, diğer klonlarla karşılaştırıldığında hasta �rneklerinde baskın olduğu ve antibiyotiklere direncin y�ksek seviyelerde olduğu g�r�lm�şt�r. Geriye kalan 2 pulsotip ana k�me ile yakın ilişkili olarak bulunmuştur (Şekil 2). Buna g�re, �alışılan 79 A.baumannii izolatının b�y�k bir kısmının klonal olarak ilişkili olduğu ve hastanemizde �apraz kontaminasyon sorununun yaşandığı belirlenmiştir.


Şekil 2

TARTIŞMA

Hastane enfeksiyonları, hastanede yatış s�resini uzatan, tedavi masraflarında b�y�k artışlara neden olan, morbidite ve mortalitesi y�ksek enfeksiyonlardır. YB�'de yatan hastalara sıklıkla girişimsel uygulamalar yapılması, altta yatan hastalıklar, enfeksiyon kontrol�ndeki yetersizlikler ve uygun olmayan ampirik tedaviler sebebiyle enfeksiyon etkeni bakteriler sıklıkla antibiyotiklere diren�li olmaktadırlar. YB�'de yatan hastaların imm�n sistemlerinin baskılanmış olması ve genellikle geniş spektrumlu antibiyotiklerin fazla kullanımı diren� sorununu daha da artırmaktadır. Ge�tiğimiz yıllarda giderek artan oranlarda �oklu ila� direnci (�İD) bildirilmiş ve başta A.baumannii olmak �zere, diğer Acinetobacter t�rleri "yeniden �nem kazanan enfeksiyon etkenleri" arasında ilk sıraları almıştır5,17. A.baumannii izole edilen klinik �rneklerin dağılımı incelendiğinde, ilk sıralarda solunum yolu �rneklerinin yer aldığı g�r�lmektedir6,18. �alışmamızda da, yaklaşık %47 (37/79) oranıyla solunum yolu �rnekleri ilk sırayı almıştır (Tablo I).�

�lkemizde farklı b�lgelerdeki �eşitli hastanelerde yapılan �alışmalarda, A.baumannii suşları i�in farklı duyarlılık sonu�ları verilirken, gittik�e artan d�zeyde antibiyotik diren� oranları bildirilmiştir18-21. Bir s�rveyans �alışmasında da, �zellikle �lkemizdeki diren� oranlarının diğer Avrupa �lkelerine g�re olduk�a y�ksek olduğu vurgulanmıştır5. A.baumannii izolatları antibiyotiklere karşı farklı diren� oranları g�stermekle birlikte, sıklıkla beta-laktam antibiyotikler, aminoglikozid ve florokinolonlara diren� g�r�lebilmektedir19. �alışmamızda en fazla piperasilin/tazobaktam direnci (%97.5) saptanmıştır. Ayrıca sefaperazon/s�lbaktam, karbapenemler, trimetoprim-s�lfametoksazol (SXT) ve siprofloksasin antibiyotiklerine karşı %90'ın �zerinde bir diren� g�r�lm�şt�r. A.baumannii klinik izolatlarının diren� durumunu değerlendiren �eşitli �alışmalarda, tedavide kullanılan antibiyotiklere karşı bizim �alışmamızda da olduğu gibi farklı oranlarda diren� bildirilmiştir18,20. �alışmamızda kinolon grubu antibiyotiklerden levofloksasine %86, siprofloksasine %96.2 oranında diren� saptanmıştır. Aminoglikozid direnci de netilmisin, amikasin ve gentamisin i�in sırasıyla, %27.8, %55.7 ve %83.6 olarak izlenmiş; �i�ek ve arkadaşları18 ise bu oranları sırasıyla %11, %63 ve %48 olarak rapor etmişlerdir.

Acinetobacter t�rlerinde g�r�len �İD, bu etkenlere bağlı enfeksiyonların tedavisinde karbapenemlerin yoğun olarak kullanımına yol a�mıştır21. Buna bağlı olarak da karbapenem direnci, son yıllarda d�nyada ve �lkemizdeki hastanelerden izole edilen A.baumannii izoatları arasında artan oranlarda bildirilmiştir22. �lkemizde imipenem direncinin %60.8-92, meropenem direncinin %64-96 arasında olduğunu bildiren �alışmalar bulunmaktadır23. Kayseri'de Alp ve arkadaşlarının24 2000-2009 yıllarını kapsayan on yıllık s�rveyans �alışmasında, A.baumannii izolatlarında karbapenem direncinin %44'ten dramatik olarak artarak %92'lere y�kseldiği ifade edilmiştir. Bizim �alışmamızda, test edilen karbapenemlere karşı %94.9 oranında diren� tespit edilmiş olup, benzer oranlar farklı �lkelerde yapılan �alışmalarda da belirtilmektedir18,25.

�alışmamızın verileri, A.baumannii enfeksiyonlarının tedavisinde en �ok kullanılan antibiyotiklere karşı d�ş�k oranlarda duyarlılık olduğunu g�stermektedir. Buna karşın izolatlarımızın hi�birinde kolistine karşı diren� g�r�lmemesi, tigesikline karşı da sadece �� izolatta (%3.8) diren� tespit edilmesi umut vericidir (Tablo III). T�rkiye'de ve yurt dışındaki �eşitli �alışmalarda tigesiklin duyarlılığının %61-100, kolistin duyarlılığının ise %91-100 arasında olduğu bildirilmiştir23. �alışmamızda olduğu gibi bazı �alışmalarda kolistin direncine rastlanmazken18,25, %96.2 duyarlılık saptadığımız tigesiklin de diren�li Acinetobacter enfeksiyonlarında kullanılabilecek bir antibiyotik olarak değerlendirilmiştir.

A.baumannii izolatlarında kazanılmış karbapenem direnci, temel olarak metallo-beta-laktamazlar (MBL) ve karbapenemi hidrolize eden sınıf D beta-laktamazlar (KHDL) olmak �zere iki tip beta-laktamazın �retimi sonucu olmaktadır. Zayıf karbapenamaz aktivitesi g�steren blaOXA-51 enzim k�mesi, A.baumannii izolatlarının hemen hepsinde doğal olarak bulunmasına karşın diğer Acinetobacter t�rlerinde bulunmamaktadır. Sadece A.baumannii izolatlarında bulunan blaOXA-51 geninin, bu t�rlerin tanımlanması i�in bir belirte� olarak kullanılabileceği bildirilmektedir12. blaOXA-51 geni, sıklıkla diğer kazanılmış blaOXA tipi genlerle birlikte bulunmakta ve belirli şartlarda karbapenem direncinde sinerjik etki yaratabilmektedir21. Acinetobacter t�rlerinde kazanılmış karbapenemi hidrolize eden oksasilinazlar arasında blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-48 ve blaOXA-58 tipi enzimler d�nyanın farklı b�lgelerinde değişen oranlarda saptanmaktadır. �in'de yapılan �alışmalarda Zhao ve arkadaşları4 %91.7 blaOXA-51, %83.3 blaOXA-23, %0.8 blaOXA-58; Hou ve arkadaşları26 %48.4 blaOXA-51, %46.3 blaOXA-23, %5.3 blaOXA-58; Ma ve arkadaşları27 %100 blaOXA-51, %46 blaOXA-58, %2.2 blaOXA-23, %0 blaOXA-24; Suudi Arabistan'da Al-Sultan ve arkadaşları28 %58 blaOXA-23, %13 blaOXA-40, %0 blaOXA-58; İran'da Mohajeri ve arkadaşları29� %77.9 blaOXA-23, %19.2 blaOXA-24 pozitifliği bildirmişlerdir. �lkemizde ise %0-23 arasında blaOXA-58, %31-78 arasında blaOXA-23 ve d�ş�k oranlarda blaOXA-24 geninin varlığı rapor edilmiştir21. �lkemizde yapılan farklı �alışmalarda1,19,18,21 olduğu gibi, bizim �alışmamızda da t�m izolatlarda blaOXA-51 geni tespit edilmiştir. Bunun yanı sıra, Keskin ve arkadaşları19 �alışmalarında %91.5 blaOXA-23, %7 blaOXA-58 ve %2� blaOXA-24; Keyik ve arkadaşları21 %46.7 blaOXA-23 ve %53.3 blaOXA-58; Ert�rk ve arkadaşları1 %94.5 blaOXA-23; �i�ek ve arkadaşları18 ise %78 blaOXA-23 gen varlığı bildirmişlerdir. �alışmamızda blaOXA-23 gen pozitiflik oranı %89.9 olarak belirlenmiştir. T�m bu sonu�lar, blaOXA-51 ve blaOXA-23 gen b�lgelerinin, A.baumannii izolatlarının imipenem direncinde baskın mekanizmayı oluşturduğunu vurgulamaktadır. Bununla birlikte, A.baumannii suşlarında blaOXA genlerinin b�lgeler arasında farklılık g�stermesinin yanında, aynı b�lgede yıllar i�erisinde de gen değişikliklerinin g�zlendiği bildirilmektedir21.

Sunulan �alışmada ayrıca, Mersin �niversitesi Hastanesi'nde enfeksiyon etkeni olarak izole edilen A.baumannii suşlarının molek�ler epidemiyolojisi de değerlendirilmiş ve A.baumannii izolatları arasındaki klonal ilişki, b�lgemizde ilk kez PFGE y�ntemi ile araştırılmıştır. �alışmamızda PFGE genotip analizi, 79 suş arasında on klonun var olduğunu g�stermiştir [A (n= 30), B (n= 20), C (n= 9), D (n= 5), E (n= 4), F (n= 3), G (n= 3), H (n= 3), I (n= 1), J (n= 1)]. Ayrıca klon A ve B hasta �rneklerinde baskın klon olarak bulunmuştur. Mersin'de G�lbudak ve arkadaşlarının20 yaptığı �alışmada, hastane enfeksiyonu etkeni olan A.baumannii izolatları arasındaki klonal ilişki Rep-PCR ile araştırılmış; iki ana klon [A (7 alt tip), B (3 alt tip)] olmak �zere toplam sekiz (A-H) farklı klon tespit edilmiş ve A klonu baskın tip olarak belirlenmiştir. �in'de yapılan bir �alışmada da, �İD olan 50 A.baumannii izolatı PFGE ile araştırılmış; 14 farklı PFGE paterni tespit edilmiş ve suşlar, A (n= 24), B (n= 6), C (n= 9) şeklinde toplanmışlardır4.

Yapılan bir�ok �alışmada, farklı OXA-tip karbapenemaz i�eren A.baumannii kaynaklı enfeksiyonlara ait klonal ilişkili salgınlar bildirilmektedir1,3,4,29-33. Hastane ekipmanları ve �alışanlar aracılığıyla servisler arasında bu klonların yayılımı m�mk�nd�r. Karag�z ve arkadaşları33 farklı �nitelerden alınan kan k�lt�r� �rneklerinden 47 ve �evre �rneklerinden yedi olmak �zere toplam 54 A.baumannii izolatının PFGE analizinde, izolatların tek bir klona ait olduğunu ve meydana gelen salgının, bir blokta yer alan YB�'den kaynaklandığını g�stermişlerdir. Bu araştırıcılar, �evresel kaynaklı �apraz bulaşı molek�ler y�ntemlerle doğrulamışlar ve �İD A.baumannii yayılımının �nlenmesi ve nozokomiyal enfeksiyonların kontrol�nde, enfeksiyon kontrol stratejilerinin eksiksiz olarak uygulanması gereğini bir kez daha vurgulamışlardır33. Ert�rk ve arkadaşları1 da, �alıştıkları 109 A.baumannii izolatının PFGE ile dokuz pulsotipe ayrıldığını; 107 (%98) izolat i�eren yedi pulsotipte 2-53 arasında değişen, birbirinden ayırt edilemeyen benzer PFGE profilleri saptadıklarını bildirmişlerdir.� Araştırıcılar ayrıca, diğer iki pulsotipin de ana k�meyle yakın ilişkili suşlar olduğunu belirtmiş; toplam 97 izolat i�eren ilk grubun %92.7 oranında benzerlik g�sterdiğini, ikinci grubun da %100 aynı olan 12 izolat i�erdiğini rapor etmişlerdir1. Mohajeri ve arkadaşlarının29 �alışmasında, 104 A.baumannii izolatının PFGE genotip analizinde sekiz klonun (A-H) bulunduğu ve hastanede baskın olan klon A'nın (n= 35) diğer klonlarla karşılaştırıldığında, y�ksek antibiyotik direnci g�steren, �zellikle enfeksiyon koğuşlarında yatan hastalardan izole edilen suşlar olduğu belirlenmiştir. Bu araştırıcılar da, hastanedeki salgından klon A'nın sorumlu olduğunu ve ayrıca hastanenin farklı b�lgelerinde saptadıkları prevalansı y�ksek diğer klonların [B (n= 29), C (n= 19)] yayılmasını �nlemek i�in dikkatli olunması gerektiğini ileri s�rm�şlerdir29. Bizim �alışmamızda, hastanemizin farklı b�l�mlerinden izole edilen A.baumannii suşlarında A (n= 30) ve B (n= 20) klonlarının y�ksek prevalansa sahip olması, hastanemizde yatan hastalar arasında bu klonların yayılımını �nlemeye y�nelik tedbirlerin yeterince alınmadığını g�stermektedir.

Sonu� olarak �alışmamızda, A.baumannii izolatlarının t�m� blaOXA-51 gen b�lgesi pozitif, 71'i (%89.9) blaOXA-23 pozitif bulunurken, hi�birinde blaOXA-58, blaOXA-48 ve blaOXA-24 bulunamamıştır. T�m izolatlar 3-30 arasında değişen sekiz pulsotipe ayrılmıştır. PFGE genotip analizi 79 suş arasında sekiz klonun var olduğunu g�stermiştir. Geriye kalan iki pulsotip, ana k�me ile yakın ilişkili suş olarak değerlendirilmiştir. Benzerlik katsayısı g�z �n�ne alındığında %85 ve �st�nde olan iki maj�r grup bulunmuştur. Bu bulgular, hastanemizde acil olarak etkin kontrol ve �nleme tedbirlerine ihtiya� olduğunu d�ş�nd�rmektedir. Karbapeneme diren�li A.baumannii klonlarının varlığının erken tespiti, bu klonların hastanede yayılımının engellenmesi i�in yararlı olacaktır.

KAYNAKLAR

  1. Ert�rk A, �i�ek A�, G�m�ş A, et al. Molecular characterisation and control of Acinetobacter baumannii isolates resistant to multi-drugs emerging in inter-intensive care units. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2014; 13: 36.
  2. Mart�nez P, Mattar S. Imipenem-resistant Acinetobacter baumannii carrying the ISAba1-bla OXA-23,51 and ISAba1-bla ADC-7 genes in Monteria, Colombia. Braz J Microbiol 2012; 43(4): 1274-80.
  3. Cicek AC, Karagoz A, Koksal E, et al. A single clone Acinetobacter baumannii outbreak in a state hospital in Turkey. Jpn J Infect Dis 2013; 66(3): 245-8.
  4. Zhao SY, Jiang DY, Xu PC, et al. An investigation of drug-resistant Acinetobacter baumannii infections in a comprehensive hospital of East China. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2015; 14:7.
  5. Souli M, Galani I, Giamarellou H. Emergence of extensively drug-resistant and pandrug-resistant Gram-negative bacilli in Europe. Euro Surveill 2008; 13(47). pii: 19045.
  6. Xu T, Xia W, Rong G, Pan S, Huang P, Gu B. A 4-year surveillance of antimicrobial resistance patterns of Acinetobacter baumannii in a university-affiliated hospital in China. J Thorac Dis 2013; 5(4): 506-12.
  7. Gon�alves CR, Vaz TM, Araujo E, Boni Rd, Leite D, Irino K. Biotyping, serotyping and ribotyping as epidemiological tools in the evaluation of Acinetobacter baumannii dissemination in hospital units, Sorocaba, S�o Paulo, Brazil. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2000; 42(5): 277-82.
  8. Lin YC, Sheng WH, Chen YC, Chang SC, Hsia KC, Li SY. Differences in carbapenem resistance genes among Acinetobacter baumannii, Acinetobacter genospecies 3 and Acinetobacter genospecies 13TU in Taiwan. Int J Antimicrob Agents 2010; 35(5): 439-43.
  9. Peleg AY, Seifert H, Paterson DL. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev 2008; 21(3): 538-82.
  10. Poirel L, Marqu� S, H�ritier C, Segonds C, Chabanon G, Nordmann P. OXA-58, a novel class D {beta}-lactamase involved in resistance to carbapenems in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49(1): 202-8.
  11. Lopes BS, Al-Agamy MH, Ismail MA, et al. The transferability of blaOXA-23 gene in multidrug resistant Acinetobacter baumannii isolates from Saudi Arabia and Egypt. Int J Med Microbiol 2015; 305(6): 581-8.
  12. Hamouda A, Evans BA, Towner KJ, Amyes SG. Characterization of epidemiologically unrelated Acinetobacter baumannii isolates from four continents by use of multilocus sequence typing, pulsed-field gel electrophoresis, and sequence-based typing of bla (OXA-51-like) genes. J Clin Microbiol 2010; 48(7): 2476-83.
  13. Clinical and Laboratory Standards Institute: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. Twenty-Third Informational Supplement M100-S22, 2012. CLSI, Wayne, PA.
  14. Zarkotou O, Pournaras S, Altouvas G, et al. Comparative evaluation of tigecycline susceptibility testing methods for expanded-spectrum cephalosporin- and carbapenem-resistant gram-negative pathogens. Clin Microbiol 2012; 50(11): 3747-50.
  15. Durmaz R, Otlu B, Koksal F, et al. The optimization of a rapid pulsed-field gel electrophoresis protocol for the typing of Acinetobacter baumannii, Escherichia coli and Klebsiella spp. Jpn J Infect Dis 2009; 62(5): 372-7.
  16. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995; 33(9): 2233-9.
  17. �ift�i İH, Aşık G. Acinetobacter baumannii'nin antibiyotik diren� mekanizmaları. ANKEM Derg 2011; 25(3):196-207.
  18. Cicek AC, Saral A, Iraz M, et al. OXA- and GES-type -lactamases predominate in extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii isolates from a Turkish University Hospital. Clin Microbiol Infect 2014; 20(5): 410-5.
  19. Keskin H, Tekeli A, Dolapci İ, �cal D. Klinik �rneklerden izole edilen Acinetobacter baumannii suşlarında beta-laktamaz kaynaklı direncin molek�ler karakterizasyonu. Mikrobiyol Bul 2014; 48(3):365-76.
  20. G�lbudak H, Aslan G, Tezcan S ve ark. Hastane enfeksiyonu etkeni olan Acinetobacter baumannii izolatları arasındaki klonal ilişkinin Rep-PCR ile araştırılması. Mikrobiyol Bul 2014; 48(2):316-24.
  21. Keyik S, Arslan U, T�rk Dağı H, Seyhan T, Fındık D. Investigation of OXA type beta-lactamases and PFGE patterns in Acinetobacter baumannii strains resistant to carbapenems. Mikrobiyol Bul 2014; 48(4):556-65.
  22. Chuang YC, Sheng WH, Lauderdale TL, et al. Molecular epidemiology, antimicrobial susceptibility and carbapenemase resistance determinants among Acinetobacter baumannii clinical isolates in Taiwan. J Microbiol Immunol Infect 2014; 47(4):324-32.
  23. Direkel Ş, Uzunoğlu E, Keleş S, Yapar K. Antibiotic resistance rates of Acinetobacter baumannii strains isolated from various clinical samples in Giresun Prof. Dr. Atilla Ilhan Ozdemir State Hospital. Gazi Medical Journal 2015; 26(3):92-6.
  24. Alp E, Kiran B, Altun D, et al. Changing pattern of antibiotic susceptibility in intensive care units: ten years experience of a university hospital. Anaerobe 2011; 17(6): 422-5.
  25. Dedeic-Ljubovic A, Granov D, Hukic M. Emergence of extensive drug-resistant (XDR) Acinetobacter baumannii in the Clinical Center University of Sarajevo, Bosnia and Herzegovina. Med Glas (Zenica) 2015; 12(2): 169-76.
  26. Hou C, Yang F. Drug-resistant gene of blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 and blaOXA-58 in Acinetobacter baumannii. Int J Clin Exp Med 2015; 8(8): 13859-63.
  27. Ma Z, Zhou LQ, Wang H, Luo LP. Investigations on the genomic diversity of OXA from isolated Acinetobacter baumannii. Genet Mol Res 2015; 14(4): 14711-6.
  28. Al-Sultan AA, Evans BA, Aboulmagd E, et al. Dissemination of multiple carbapenem-resistant clones of Acinetobacter baumannii in the Eastern District of Saudi Arabia. Front Microbiol 2015; 6: 634.
  29. Mohajeri P, Farahani A, Feizabadi MM, Ketabi H, Abiri R, Najafi F. Antimicrobial susceptibility profiling and genomic diversity of Acinetobacter baumannii isolates: a study in western Iran. Iran J Microbiol 2013; 5(3): 195-202.
  30. Metan G, Sariguzel F, Sumerkan B, Reijden Tv, Dijkshoorn L. Clonal diversity and high prevalence of OXA-58 among Acinetobacter baumannii isolates from blood cultures in a tertiary care centre in Turkey. Infect Genet Evol 2013; 14: 92-7.
  31. Ece G, Erac B, Yurday Cetin H, Ece C, Baysak A. Antimicrobial susceptibility and clonal relation between Acinetobacter baumannii strains at a Tertiary Care Center in Turkey. Jundishapur J Microbiol 2015; 8(2): e15612.
  32. Cetin ES, Durmaz R, Tetik T, Otlu B, Kaya S, Calişkan A. Epidemiologic characterization of nosocomial Acinetobacter baumannii infections in a Turkish university hospital by pulsed-field gel electrophoresis. Am J Infect Control 2009; 37(1): 56-64.
  33. Karag�z A, Baran I, Aksu N, Acar S, Durmaz R. Characterization and determination of antibiotic resistance profiles of a single clone Acinetobacter baumannii strains isolated from blood cultures. Mikrobiyol Bul 2014; 48(4): 566-76.

İletişim (Correspondence):

Yrd. Do�. Dr. Şahin Direkel,

Giresun �niversitesi Tıp Fak�ltesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

Nizamiye Yerleşkesi, Orhan Yılmaz Caddesi

Mumcular Sokak No: 1/1, Giresun, T�rkiye

Tel (Phone): +90 454 310 1600,

E-posta (E-mail): sdirekel@yahoo.com

Yazdır