Yazdır

Kısa Bildiri/Short Communication
Mikrobiyol Bul 2015; 49(4): 594-599

Yedi Yıllık Sürede Klinik Örneklerden İzole Edilen Staphylococcus aureus Suşlarında
mecC ve Panton-Valentine Lökosidin Gen Varlığının Araştırılması

Investigation of the Presence of mecC and Panton-Valentine Leukocidin Genes in
Staphylococcus aureus Strains Isolated from Clinical Specimens During Seven Years Period

Abdullah KILIÇ1, Eyüp DOĞAN1, Sinem KAYA1, Mehmet BAYSALLAR1

1 Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.

1 Gulhane Military Medical Academy, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

ÖZ

Klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA)'un saptanması ve tanımlanması, uygun tedavi seçimi ve epidemiyolojik verilerin elde edilmesi için önemlidir. mecC geni, mecA genine yaklaşık %69 DNA benzerliği gösteren bir mecA homoloğudur ve PBP2a/2' proteinine yaklaşık %63 benzerlik gösteren proteini kodlamaktadır. Çeşitli çalışmalar, mecC pozitif MRSA izolatlarının, çapraz kontaminasyon ile çiftlik hayvanlarından insanlara bulaştığını desteklemektedir. Panton-Valentine lökosidini (PVL) ise, S.aureus'un potent sitotoksini olup, önemli bir virülans faktörü olarak kabul edilmektedir. Bu çalışmada, klinik örneklerden izole edilen S.aureus suşlarında mecC ve pvl gen varlığının ve prevalansının araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, Ocak 2007-Aralık 2014 tarihleri arasında hastanemizde izole edilmiş olan 1177'si metisiline duyarlı S.aureus (MSSA) ve 523'ü MRSA olmak üzere toplam 1700 S.aureus izolatı dahil edilmiştir. İzolatlar, konvansiyonel yöntemler ve BD Phoenix otomatize sistemi (BD Diagnostic Instrument Systems, ABD) ile tanımlanmıştır. Antibiyotik duyarlılık testi, oksasilin (1 μg) ve sefoksitin (30 μg) için Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemiyle CLSI standartlarına göre yapılmıştır. mecA gen varlığı gerçek zamanlı PCR; pvl ve mecC gen varlığı ise konvansiyonel PCR yöntemi ile araştırılmıştır. Suşların izole edildiği hastaların %44.6 (759/1700)'sı poliklinik hastası ve %65.8 (1119/1700)'i erkek olup, yaş ortalaması 39.7 yıldır. Çalışmamızda değerlendirilen 1700 izolatın 523 (%30.7)'ünde mecA geni pozitif bulunmuş; hiçbir izolatta mecC geni tespit edilmemiştir. MSSA izolatlarının %1.9 (23/1177)'u ve MRSA izolatlarının %1.7 (9/523)'sinde olmak üzere, toplam 32 (%1.8) izolatta pvl geni pozitif bulunmuştur. PVL pozitif S.aureus'ların %56.2 (18/32)'sinin, deri ve yumuşak doku enfeksiyonu örneklerinden izole edildiği belirlenmiştir. Saptanan PVL pozitiflik oranı, ülkemizde daha önce yapılan çalışmalar ile benzer bulunmuştur. Bu çalışma, ulaşılabilen kaynaklara göre, ülkemizde mecC tespiti ile ilgili olarak yapılan ilk çalışmadır. Çalışmamızda, mecC geni taşıyan S.aureus izolatı saptanmamış olsa da, bölgesel epidemiyolojik verilerin hızla değişebileceği göz ardı edilmemelidir. Sonuç olarak, ülkemizde mecC geninin araştırılmasına yönelik, hayvan izolatlarının da tarandığı çok merkezli çalışmalara gerek olduğu düşünülmüştür.

Anahtar sözcükler: Staphylococcus aureus; mecA geni; mecC geni; Panton-Valentine lökosidini.

ABSTRACT

Detection and identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in clinical microbiology laboratories are important for the selection of appropriate treatment and obtaining epidemiological data. mecC gene, is a mecA homologue, showing almost 69% DNA similarity with the mecA gene and the encoded protein by this gene shows almost 63% similarity with the PBP2a/2' protein. Several studies indicated that mecC positive MRSA strains can be transmitted from the livestock to humans by cross contamination. Panton-Valentine leukocidin (PVL), a potent cytotoxin of S.aureus is also considered as an important virulence factor. The aim of this study was to determine the existence and prevalence of mecC and pvl genes among S.aureus strains isolated from clinical specimens. A total of 1700 S.aureus isolates including 1177 methicillin-susceptible S.aureus (MSSA) and 523 MRSA, isolated in our hospital between January 2007 to December 2014, were included in the study. The isolates were identified by both conventional methods and BD Phoenix automated system (BD Diagnostic Instrument Systems, USA). Antibiotic susceptibility testing was performed by Kirby-Bauer disk diffusion method with oxacillin (1 μg) and cefoxitin (30 μg) according to the CLSI standards. The presence of mecA gene was investigated by the use of real-time PCR, and the presence of pvl and mecC genes were detected by conventional PCR method. Among the patients, 44.6% (759/1700) were outpatients, 65.8% (1119/1700) were male and the mean age of of patients was 39.7 years. Of 1700 isolates evaluated in this study, 523 (30.7%) were positive for mecA gene, however all of them were negative for mecC gene. A total of 32 (1.8%) isolates were positive for pvl gene including 23 (1.9%) out of 1177 MSSA and nine (1.7%) out of 523 MRSA strains. Eighteen (56.2%) of the PVL-positive S.aureus strains were isolated from skin and soft tissue infections. The frequency of PVL detected in this study was similar to the data of previous studies in our country. To the best of our knowledge, this is the first study for the determination of the mecC in our country. Although the mecC gene positive S.aureus has not been detected in our study, it should be kept in mind that the regional epidemiological conditions can vary quickly. In conclusion, multicenter studies are needed for the screening of mecC gene including the animal isolates, in Turkey.

Keywords: Staphylococcus aureus; mecA gene; mecC gene; Panton-Valentine leukocidin.

Geliş Tarihi (Received): 19.03.2015 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 30.06.2015

GİRİŞ

Güney Batı İngiltere'de sığır mastiti ile ilgili yapılan bir çalışmada süt tankından alınan bir örnekte fenotipik olarak oksasilin ve metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) izolatı tanımlanmıştır1. Ancak doğrulama için yapılan testlerde mecA geni taşımadığı ve PBP2a/2' aglütinasyon testinin negatif olduğu görülmüş ve izolat LGA251 olarak isimlendirilmiştir. LGA251 izolatının yapılan genom dizi analizinde, klasik mecA genine yaklaşık %69 benzerlik gösteren bir mecA homoloğu taşıdığı (mecALGA251), bu genin PBP2a/2' proteinine ise yaklaşık %63 benzerlik gösteren proteini kodladığı tespit edilmiş ve 2012 yılında mecC olarak isimlendirilmiştir1.

Panton-Valentine lökosidini (PVL), toplum kaynaklı MRSA'larda sık olarak bulunan bir virülans faktörüdür. PVL ile ilişkili enfeksiyonlar, öncelikle deri ve yumuşak dokuda başlamakta, enfeksiyon daha sonra akciğerlere yayılmakta, nekrotizan pnömoni tablosu oluşturmakta ve akciğer dokusunu harap ederek olguların %75'inde ölümle sonuçlanmaktadır2. Bu çalışmada, 2007-2014 yılları arasında hastanemizde izole edilmiş olan S.aureus izolatlarında, mecC ve pvl gen varlığının ve prevalansının araştırılması amaçlanmıştır.

GEREÇ ve YÖNTEM

Bakteriyel İzolatlar

Çalışmaya, Ocak 2007-Aralık 2014 tarihleri arasındaki yedi yıllık dönem içerisinde, kliniklerde yatan ve polikliniklere başvuran hastalardan gönderilen örneklerden izole edilmiş olan 1177'si metisiline duyarlı S.aureus (MSSA) ve 523'ü MRSA olmak üzere toplam 1700 izolat dahil edildi. S.aureus üremesi olan hastalara ait demografik veriler (yaş ve cinsiyet), klinik örneğin alındığı yer ve tarihe ait bilgiler kayıt sistemimizden temin edildi. Suşlar, izole edildikleri tarihte öncelikle konvansiyonel yöntemler, sonrasında BD Phoenix otomatize sistem (Becton Dickinson Diagnostic Systems, ABD) ile tanımlanmış ve %10'luk skim milk solüsyonunda -80ºC'de saklanmıştı. İzolatların 594 (%34.9)'ü deri ve yumuşak doku, 504 (%29.6)'ü solunum yolu, 274 (%16.1)'ü kan, 252 (%14.8)'si idrar ve 76 (%4.4)'sı diğer örneklerden (kateter, göz sürüntü örneği gibi) izole edilmişti. Suşların izole edildiği hastaların 759 (%44.6)'u poliklinik hastası ve 1119 (%65.8)'u erkek olup, yaş ortalaması 39.7 yıldır.

Çalışmada kontrol suşu olarak; S.aureus NCTC 10442 (mecA pozitif), S.aureus N315 (mecA pozitif), S.aureus ATCC 29213 (mecA negatif), S.aureus ATCC 25923 (pvl pozitif) ve mecC geni pozitif S.aureus [Prof. Anders Rhod Larsen (Statens Serum Institut, Danimarka)'den temin edildi] kullanıldı.

Antibiyotik Duyarlılık Testi

Antibiyotik duyarlılık testi, oksasilin (1 μg) ve sefoksitin (30 μg) için Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemiyle CLSI standartlarına göre yapıldı3. İnhibisyon zon çapları sefoksitin için ≤ 19 mm ve oksasilin için ≤ 10 mm olan suşlar metisiline dirençli olarak kabul edildi. Ayrıca PVL pozitif bulunan izolatların antibiyotik duyarlılık testleri Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi ile CLSI standartlarına göre yapıldı ve değerlendirildi3.

pvl, mecA ve mecC Genlerinin Saptanması

İzolatların DNA izolasyonu, kaynatma metodu kullanılarak yapıldı. mecA gen varlığı, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile Kılıç ve arkadaşlarının4; pvl ve mecC gen varlığı ise konvansiyonel PCR yöntemi ile Stegger ve arkadaşlarının5 çalışmalarındaki gibi araştırıldı. Çalışmada sadece pvl ve mecC gen bölgelerini tespit etmek için gerekli olan primerler kullanıldı. PCR döngüleri 94°C'de 15 dakika başlangıç denatürasyonu, takibinde 30 döngü 94°C'de 30 saniye, 59°C'de 1 dakika, 72°C'de 1 dakika ve son olarak 72°C'de 10 dakika son uzama olacak şekilde ayarlandı.

BULGULAR

Gerçek zamanlı PCR ile suşların 523 (%30.7)'ünde mecA geni pozitif olarak tespit edilmiş; bu izolatlar, fenotipik olarak da oksasilin ve sefoksitine dirençli bulunmuştur. Toplam 1700 izolatın hiçbirisinde mecC geni saptanmamıştır (Şekil 1). mecA ve mecC geni tespit edilmeyen izolatların hepsinin oksasilin ve sefoksitine duyarlı olduğu belirlenmiştir. MSSA izolatlarının %1.9 (23/1177)'unda, MRSA izolatlarının ise %1.7 (9/523)'sinde olmak üzere, toplam 32 (%1.8) izolatta pvl geni pozitif bulunmuştur. Bu 32 suşun 31 (%96.8)'i ayaktan başvuran hastaların örneklerinden izole edilmiştir. PVL pozitif S.aureus'ların 18 (%56.2)'i deri ve yumuşak doku, 9 (%28.1)'u solunum yolu, 3 (%9.3)'ü kan ve 2 (%6.2)'si idrar örneklerinden izole edilen suşlardır. Bu izolatların hepsi (n= 32) linezolid ve vankomisine duyarlı iken, 13 (%40.6)'ü eritromisine; 9 (%28.1)'u metisilin, tetrasiklin ve klindamisine; 7 (21.8)'si rifampin ve levofloksasine; 2 (%6.2)'si ise trimetoprim-sülfametoksazole dirençli bulunmuştur.


Şekil 1

TARTIŞMA

mecC MRSA izolatları oksasiline duyarlı veya orta düzey duyarlı olabileceğinden, fenotipik yöntemler ile MSSA olarak yanlış tanımlanabilmektedir. Disk difüzyon, sıvı dilüsyon ve agar dilüsyon yöntemlerinde sefoksitin, oksasiline göre daha güvenilir sonuçlar vermektedir; ancak farklı ticari sistemlere ait agarlara bağlı olarak sonuçlar değişebilmektedir6. Fenotipik yöntemlerin mecC tespitindeki yetersizliğinden dolayı, DNA temelli yöntemlerin mecC tespitinde etkili olduğu düşünülmektedir7.

Klasik mecA dışında, mecC içeren MRSA izolatlarının rutinde güvenilir bir şekilde tespit edilmesi, uygun hastane kontrol önlemlerinin alınması ve tedavi protokolünün planlanması için önemlidir7. Birçok epidemiyolojik çalışma yapılmasına rağmen, mecC geninin kökeni tam olarak anlaşılamamıştır. Kesin olmamakla birlikte, yapılan birçok çalışma, mecC MRSA izolatlarının çapraz kontaminasyon ile çiftlik hayvanlarından insanlara bulaşmış olabileceğini desteklemektedir8. mecC MRSA'nın gerçek dağılımını gösteren çalışmalar nadirdir ve çoğu retrospektif olarak yapılmıştır. Danimarka'da 2003-2011 yılları arasında yapılan bir çalışmada, mecC oranının %1.5 olduğu ve yıllar içinde artış gösterdiği bildirilmiştir9. Almanya'da 2004-2005 yıllarında toplanan 1604, 2010-2011 yılları arasında toplanan 1603 MRSA çalışılmış ve her iki dönemde de sadece birer izolatın mecC pozitif olduğu (%0.06) bulunmuştur10. İsviçre'de 2005-2011 yıları arasında izole edilen 80 MRSA izolatında11, Amerika Birleşik Devletleri (ABD)'nde 50 yaralı asker personelden izole edilmiş 102 MRSA izolatında12 ve İngiltere'de 2012-2013 yılları arasında toplanan toplam 500 S.aureus'un hiçbirinde mecC varlığı saptanmamıştır13. Çalışmamızda 2007-2014 yılları arasında çeşitli klinik örneklerden izole edilmiş 1177 MSSA, 523 MRSA örneği çalışılmış ve mecC geni tespit edilmemiştir. Bu bize, hastanemizin henüz mecC açısından risk altında olmadığını göstermektedir.

Panton-Valentine lökosidini, S.aureus'ların önemli bir virülans faktörü olarak bilinmektedir. PVL taşıyan S.aureus'lar ciddi deri ve yumuşak doku enfeksiyonları, nekrotizan fasiit ve hemorajik pnömoni gibi hayatı tehdit eden enfeksiyonlara neden olmaktadır2. Fransa'da 77 MRSA'da %33.814, İsviçre'de 47 MRSA'da %59.515 ve Almanya'da 19 MRSA'da %63, 93 MSSA'da %4516 oranlarında PVL pozitiflikleri bildirilmiştir. ABD'de yapılan bir araştırmada ise, çalışılan tüm S.aureus izolatları PVL pozitif olarak bulunmuştur17. Meksika'da18 291 S.aureus ve İran'da19 296 S.aureus ile yapılan çalışmalarda ise PVL pozitif izolat tespit edilmemiştir. Türkiye'de yapılan çalışmalarda bu oran %0 ile %4 arasında değişmektedir4,20,21,22,23. Çalışmamızda, ülkemizdeki çalışmalara benzer olarak, 523 MRSA izolatının dokuzu (%1.7) ve 1177 MSSA izolatının 23 (%1.9)'ü PVL pozitif olarak bulunmuştur. PVL, çoğunlukla deri ve yumuşak doku enfeksiyonlarından izole edilen suşlarda pozitif olarak tespit edilmektedir14,15. Çalışmamızda, PVL pozitif izolatların %56.2 (18/32)'si deri ve yumuşak doku enfeksiyonlarından izole edilmiştir.

Sonuç olarak, çalışmamızda mecC pozitif S.aureus izolatı tespit edilmemiştir. Ancak bölgesel epidemiyolojik değişikliklerin hızlı olabileceği göz ardı edilmemelidir. PVL pozitiflik oranı ABD, Avrupa ve Afrika ülkeleri ile kıyaslandığında ülkemizde düşüktür. S.aureus'un önemli bir virülans faktörü olan PVL'nin zaman içindeki değişimlerinin takip edilmesi, epidemiyolojik olarak önem taşımaktadır.

KAYNAKLAR

  1. Ariza-Miguel J, Hernández M, Fernández-Natal I, Rodríguez-Lázaro D. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus harboring mecC in livestock in Spain. J Clin Microbiol 2014; 52(11): 4067-9.
  2. Gillet Y, Issartel B, Vanhems P, et al. Association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leukocidin and highly lethal necrotising pneumonia in young immunocompetent patients. Lancet 2002; 359(9308): 753-9.
  3. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 22nd Informational Supplement. CLSI M100-S22, 2012. CLSI, Wayne, PA.
  4. Kilic A, Muldrew KL, Tang YW, Basustaoglu AC. Triplex real-time polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci and determination of methicillin resistance directly from positive blood culture bottles. Diagn Microbiol Infect Dis 2010; 66(4): 349-55.
  5. Stegger M, Andersen PS, Kearns A, et al. Rapid detection, differentiation and typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus harbouring either mecA or the new mecA homologue mecA(LGA251). Clin Microbiol Infect 2012; 18(4): 395-400.
  6. Skov R, Larsen AR, Kearns A, et al. Phenotypic detection of mecC-MRSA: cefoxitin is more reliable than oxacillin. J Antimicrob Chemother 2014; 69(1): 133-5.
  7. Becker K, Ballhausen B, Köck R, Kriegeskorte A. Methicillin resistance in Staphylococcus isolates: the “mec alphabet” with specific consideration of mecC, a mec homolog associated with zoonotic S.aureus lineages. Int J Med Microbiol 2014; 304(7): 794-804.
  8. Harrison EM, Paterson GK, Holden MT, et al. Whole genome sequencing identifies zoonotic transmission of MRSA isolates with the novel mecA homologue mecC. EMBO Mol Med 2013; 5(4): 509-15.
  9. Petersen A, Stegger M, Heltberg O, et al. Epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying the novel mecC gene in Denmark corroborates a zoonotic reservoir with transmission to humans. Clin Microbiol Infect 2013; 19(1): E16-22.
  10. Schaumburg F, Köck R, Mellmann A, et al. Population dynamics among methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates in Germany during a 6-year period. J Clin Microbiol 2012; 50(10): 3186-92.
  11. Basset P, Prod'hom G, Senn L, Greub G, Blanc DS. Very low prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying the mecC gene in western Switzerland. J Hosp Infect 2013; 83(3): 257-9.
  12. Ganesan A, Crawford K, Mende K, et al. Evaluation for a novel methicillin resistance (mecC) homologue in methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates obtained from injured military personnel. J Clin Microbiol 2013; 51(9):3073-5.
  13. Saeed K, Ahmad N, Dryden M, et al. Oxacillin-susceptible methicillin-resistant Staphylococcus aureus (OS-MRSA), a hidden resistant mechanism among clinically significant isolates in the Wessex region/UK. Infection 2014; 42(5): 843-7.
  14. van der Mee-Marquet N, Poisson DM, Lavigne JP, et al. The incidence of Staphylococcus aureus ST8-USA300 among French pediatric inpatients is rising. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2015; 34(5): 935-42.
  15. Seidl K, Leimer N, Palheiros Marques M, et al. USA300 methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Zurich, Switzerland between 2001 and 2013. Int J Med Microbiol 2014; 304(8): 1118-22.
  16. Waldenburger S, Vogel U, Goebeler M, Kolb-Mäurer A. Community-acquired skin infections caused by Staphylococcus aureus: what is the role of the Panton-Valentine leukocidin toxin? J Dtsch Dermatol Ges 2014; 12(1): 59-66.
  17. Dozois A, Thomsen I, Jimenez-Truque N, et al. Prevalence and molecular characteristics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus among skin and soft tissue infections in an emergency department in Guyana. Emerg Med J 2014; pii: emermed-2013-203373. [Epub ahead of print].
  18. Borbón-Esquer EM, Villaseñor-Sierra A, Martínez-López E, Jáuregui-Lomeli JJ, Villaseñor-Martínez R, Ruiz-Briseño Mdel R. SCCmec types and pvl gene in methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains from children hospitalized in a tertiary care hospital in Mexico. Scand J Infect Dis 2014; 46(7): 523-7.
  19. Rezaei M, Moniri R, Mousavi SG. Molecular analysis and susceptibility pattern of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains in emergency department patients and related risk factors in Iran. J Hosp Infect 2015; 89(3): 186-91.
  20. Tekeli A, Koyuncu E, Dolapçi I, Akan OA, Karahan ZC. Molecular characteristics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated from blood cultures between 2002-2005 in Ankara University Hospital. Mikrobiyol Bul 2009; 43(1): 1-10.
  21. Gülmez D, Sancak B, Ercis S, Karakaya J, Hasçelik G. Investigation of SCCmec types and Panton-Valentine leukocidin in community-acquired and nosocomial Staphylococcus aureus strains: comparing skin and soft tissue infections to the other infections. Mikrobiyol Bul 2012; 46(3): 341-51.
  22. Bozdoğan B, Yıldız O, Oryaşın E, et al. t030 is the most common spa type among methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated from Turkish hospitals. Mikrobiyol Bul 2013; 47(4): 571-81.
  23. Yılmaz S, Kılıç A, Karagöz A, et al. Investigation of various virulence factors among the hospital and community-acquired Staphylococcus aureus isolates by real-time PCR method. Mikrobiyol Bul 2012; 46(4): 532-45.

İletişim (Correspondence):

Doç. Dr. Abdullah Kılıç,

Gülhane Askeri Tıp Akademisi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

Etlik, 06010, Ankara, Türkiye.

Tel (Phone): +90 312 304 3412,

E-posta (E-mail): abkilic@gata.edu.tr

Yazdır