Aydın İlinde Elde Edilen Blastocystis İzolatlarının Alt Tip Dağılımı ve
Klinik Semptomların Değerlendirilmesi
Subtype Distribution of Blastocystis Isolates and Evaluation of Clinical Symptoms Detected in
Aydin Province, Turkey
Sema ERTUĞ1, Erdoğan MALATYALI1, Hatice ERTABAKLAR1, Serçin ÖZLEM ÇALIŞKAN2, Bülent BOZDOĞAN3
1 Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı, Aydın.
1 Adnan Menderes University Faculty of Medicine, Department of Medical Parasitology, Aydin, Turkey.
2 Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Biyofizik Anabilim Dalı, Aydın.
2 Adnan Menderes University Faculty of Medicine, Department of Biophysics, Aydin, Turkey.
3 Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Aydın.
3 Adnan Menderes University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Aydin, Turkey.
ÖZ
Blastocystis, dünyada ve ülkemizde rutin dışkı incelemelerinde en sık rastlanılan parazitlerden biri olup, genetik çeşitliliği ve patojenitesiyle ilgili oldukça tartışmalı bir konumdadır. İnsan ve hayvanları enfekte eden Blastocystis'in günümüzde çok sayıda alt tipi (Subtype; ST) tanımlanmış, bunlardan dokuzu insanlardan izole edilmiştir. Kolon yerleşimli anaerobik bir parazit olan Blastocystis uzun yıllar flora üyesi olarak kabul edilmiş ve enfeksiyonun genelde asemptomatik seyrettiği bildirilmiştir. Buna karşın son yıllarda, parazitin genotipleri ile patojenitesi ve klinik semptomlar arasında ilişki olduğunu gösteren bulgular elde edilmiştir. Bu çalışmada, Adnan Menderes Üniversitesi Parazitoloji Laboratuvarına gönderilen dışkı örneklerinde saptanan Blastocystis izolatlarının alt tiplerinin belirlenmesi ve parazitle ilişkili kinik semptomların değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya, Blastocystis ile enfekte 61 olgu (40 erkek, 21 kadın; yaş aralığı: 5-69 yıl, yaş ortalaması: 35 ± 19.1 yıl) dahil edilmiştir. Direkt mikroskobik incelemede Blastocystis kistleri görülen dışkı örnekleri Jones besiyerine ekilmiş ve 37°C'de 72 saatlik inkübasyon ile parazit çoğaltılmıştır. Genomik DNA izolasyonu, ticari bir kit ile (DNAzol, Invitrogen, ABD) besiyerlerinden direkt olarak veya saklanan pelletlerden yapılmıştır. Blastocystis genotipleri alt tipe özgül primerlerin kullanıldığı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile araştırılmış ve olgularda görülen semptomlar retrospektif olarak değerlendirilmiştir. PCR ile 61 Blastocystis izolatının 44 (%72.1)'ünde alt tip tayini yapılabilmiş, 17 (%27.9) izolat ise tiplendirilememiştir. Örneklerin 17 (%38.6)'si ST3, 13 (%29.5)'ü ST2 ve 9 (%20.5)'u ST1 olarak saptanmış; 4 (%9.1) örnekte ST1 ve ST3, 1 (%2.3) örnekte ise ST1 ve ST2 birlikte tespit edilmiştir. Blastocystis pozitif olgularda saptanan şikayetler sırasıyla; karın ağrısı (n= 24, %39.4), kaşıntı (n= 22, %36.1), ishal (n= 4, %6.6) ve kabızlık (n= 2, %3.3) olarak izlenmiştir. Bu çalışma ile Aydın ilinde Blastocystis genetik çeşitliliği ilk kez araştırılmış olup, bulgular diğer bölgelerden bildirilenlerle örtüşmektedir. Ülkemizde yapılan diğer çalışmalarda olduğu gibi baskın alt tipin ST3 olduğu saptanmış ve bu veri ST3'ün insan kaynaklı izolat olduğu fikrini desteklemiştir. Ayrıca, Blastocystis saptanan olgularda kaşıntı şikayetinin diğer çalışmalara göre daha yüksek oranda görülmesi dikkat çekici bulunmuştur. Sonuç olarak, parazitin patojenitesi ve ülkemizde Blastocystis enfeksiyonlarının epidemiyolojisinin aydınlatılmasında, çok merkezli ve geniş kapsamlı moleküler ve klinik çalışmalara gereksinim olduğu düşünülmüştür.
Anahtar sözcükler: Blastocystis; alt tip; enfeksiyon; Aydın.
ABSTRACT
The pathogenic potential and genetic diversity of Blastocystis are poorly understood despite being one of the most frequent intestinal parasites in routine fecal examination all around the world as well as Turkey. There are numerous defined subtypes (ST) of Blastocystis which infect animals and nine of them were isolated from human fecal samples. Blastocystis is an anaerobic parasite and generally recognized as nonpathogenic microorganism that colonizes the colon. However recent studies have indicated that the genotypes may be related with the pathogenicity and clinical symptoms of the infection. The aims of this study were to investigate the subtypes of Blastocystis isolates obtained from stool samples submitted to the parasitology laboratory of Adnan Menderes University, Faculty of Medicine, and to evaluate the clinical symptoms of infected cases. A total of 61 cases (40 male, 21 female; age range: 5-69 years, mean age: 35 ± 19.1 years) were included in the study. Stool samples that were positive for Blastocystis cysts in direct microscopic examination, were inoculated in Jones medium and incubated at 37°C for 72 hours for the growth of parasite. Genomic DNAs were isolated from Jones medium directly or frozen samples with a commercial kit (DNAzol, Invitrogen, USA). The subtypes of Blastocystis were detected by polymerase chain reaction (PCR) using ST-specific primers and the symptoms of patients were evaluated retrospectively. Forty-four (72.1%) out of 61 isolates were subtyped by PCR, while 17 (27.9%) could not be typed. The distribution of Blastocystis subtypes were found as follows; ST3 in 17 (38.6%), ST2 in 13 (29.5%), ST1 in 9 (20.5%), ST1 + ST3 in 4 (9.1%), and ST1 + ST2 in one (2.3%) of the samples. The most common symptoms among Blastocystis infected cases were abdominal pain (n= 24, 39.4%), pruritus (n= 22, 36.1%), diarrhea (n= 4, 6.6%) and constipation (n= 2, 3.3%), respectively. This is the first study investigating the genotypes of Blastocystis in Aydin province (located at Aegean region of Turkey), and the findings were consistent with those reported from other regions. The predominant subtype was found as ST3, like other studies in our country and this data supports that ST3 is a human originated genotype of Blastocystis. Additionally, the higher rate of pruritus detected among our patients infected with Blastocystis compared with the other studies was considered remarkable. In conclusion, multicenter and large-scaled molecular and clinical studies are needed to elucidate the pathogenicity and the epidemiology of Blastocystis infections.
Keywords: Blastocystis; subtype; infection; Turkey.
Geliş Tarihi (Received): 09.09.2014 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 05.11.2014
GİRİŞ
Blastocystis, insan ve hayvanlarda bulunabilen kolon yerleşimli anaerobik bir protozoondur. Dışkı örneklerinde en sık rastlanan protozoon olarak bildirilen Blastocystis, kozmopolit bir dağılım göstermektedir1. Tanıda kullanılan geleneksel parazitolojik incelemelerin yanı sıra son yıllarda moleküler yöntemlerin kullanılması, gelişmiş ülkelerde de yaygınlığın tahmin edilenden yüksek olduğunu göstermektedir2. Blastocystis yaygınlığını etkileyen faktörler; hayvanlarla yakın temas, yetersiz hijyen koşulları, kontamine yiyecek ve su kaynakları olarak bildirilmiştir3,4.
Blastocystis'in patojenitesi parazitle ilgili tartışılan konuların başında gelmektedir. Parazitin hem semptomlu hem de semptomsuz gruplarda görülmesi ve bildirilen semptomların özgül olmaması, bunun temelini oluşturmaktadır2. Oldukça polimorfik ve haploid bir genoma sahip olan Blastocystis'in, SSU rDNA analizleri sonucu alt tip (ST) olarak adlandırılan 17 farklı genotipi tanımlanmıştır5. İnsanlardan izole edilen dokuz alt tipi bulunmakta olup, bunlardan başta ST3 olmak üzere, ST1, ST2 ve ST4 insanlar arasında en yaygın bildirilen genotiplerdir6. Alt tipler ile konak özgüllüğü arasında ilişkiler kurulabilmiş ancak patojenite konusunda yapılan çok sayıda araştırmaya rağmen henüz benzer bir ilişkiden söz etmenin mümkün olmadığı bildirilmiştir7. Blastocystis patojenitesinin konağın yaşı, immünitesi, parazitin genotipi, virülansı ve zoonotik potansiyeli gibi birçok faktöre bağlı olduğu düşünülmektedir8.
Türkiye'de yapılan çalışmalarda9,10,11 Blastocystis prevalansı %1.4-%23.5 arasında değişen oranlarda verilmekte olup, Aydın'da bu oranlar %2.3-%15.5 olarak bildirilmiştir12,13. Aydın ilinde bugüne kadar Blastocystis alt tipleri konusunda bir çalışma yapılmamıştır. Bu çalışmada, Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Parazitoloji Laboratuvarında izole edilen Blastocystis suşlarının alt tiplerinin saptanması ve olgulardaki semptomların araştırılması amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM
Çalışmaya, Adnan Menderes Üniversitesi, Araştırma ve Uygulama Hastanesi, Parazitoloji Laboratuvarına değişik polikliniklerden rutin parazitolojik inceleme için gönderilen dışkı örneklerinden elde edilen 61 Blastocystis izolatı dahil edildi. Hastalara ait bilgiler hastane bilgi sisteminden retrospektif olarak tarandı, demografik ve klinik özellikleri kaydedildi.
Direkt mikroskobik incelemede Blastocystis saptanan dışkı örneklerinden yaklaşık 50 mg alınarak aynı gün 3 ml Jones besiyerine ekildi ve besiyerleri 37oC'de 48-72 saat inkübe edildi14. Besiyeri hazırlanırken kaynakta15 bildirilenden farklı olarak at serumu yerine fetal dana serumu kullanıldı. Blastocystis görülen kültürler 3-4. gün 12.000 x g'de bir dakika santrifüj edildi ve pelletler DNA izolasyonunda kullanıldı.
Saklanan ve/veya taze pelletlerden DNA izolasyonu, DNAzol kiti (Invitrogen Life Technologies, ABD) ile üretici firmanın önerileri doğrultusunda yapıldı. Blastocystis alt tiplerinin belirlenmesinde Yoshikawa ve arkadaşları16 tarafından yedi farklı alt tip için (ST1-7) özgül olarak tasarlanan primerler kullanılarak PCR uygulandı. PCR karışımı; 2 μl kalıp DNA, 0.4 pmol her bir primer, 0.3 U Taq DNA polimeraz, 0.2 mM her bir dNTP, 3 μl 10x Taq polimeraz tamponu (NH4)2SO4 şeklinde hazırlandı (Fermentas, ABD) ve distile su ile 30 μl'ye tamamlandı. Amplifikasyon ısı döngü cihazında; 94oC'de 3 dk ön denatürasyon sonrası, 30 döngü (94ºC'de 30 sn, 59ºC'de 30 sn ve 72ºC'de 60 sn) ve 72ºC'de 5 dk son uzama olarak gerçekleştirildi. 10 μl PCR ürünü %1 agaroz jelde tris borik asit-EDTA tamponunda yürütüldükten sonra agaroz jel görüntüleme sistemi (Infinity, Vilber Lourmat, Fransa) ile görüntülendi (Resim 1).
BULGULAR
Çalışmaya alınan 61 dışkı örneğinin 40'ı erkek, 21'i kadın olguya ait olup, olguların yaş ortalaması 35 ± 19.1 (yaş aralığı: 5-69) yıldır (Tablo I). Örneklerin besiyerinde kültürü sonucu çoğaltılan 61 izolatın 44 (%72.1)'ünde alt tipe özgül primerlerle amplifikasyon gözlenmiştir (Resim 1). En sık saptanan alt tip ST3 (n= 21, %47.7) olmuş, bunu ST2 (n= 14, %31.8) ve ST1 (n= 14, %31.8) izlemiştir. Blastocystis saptanan olguların demografik ve klinik özellikleri ile alt tiplerin dağılımı Tablo I'de gösterilmiştir.
TARTIŞMA
Blastocystis insanlar arasında yaygın görülen bir parazit olmasına karşın, patojenik rolü ve genetik çeşitliliği konusunda halen yeterli bilgi bulunmamaktadır8. Laboratuvarımıza gönderilen dışkı örneklerinin direkt mikroskobik incelemesinde saptanan ve kültürde üretilen Blastocystis alt tiplerinin araştırıldığı bu çalışmada, izolatların %47.7'sinin ST3 olduğu belirlenmiştir. Benzer şekilde dünya genelinde ve ülkemizde yapılan çalışmaların çoğunda en yaygın saptanan alt tipin ST3 olduğu bildirilmiştir5,17,18,19,20. Abdulsalam ve arkadaşları21 ST1'in kadınlarda anlamlı bir şekilde daha sık olduğunu bildirmiş ve ST3'ü diyare ile ilişkilendirmiştir. Doğruman ve arkadaşları22 ise, irritabl bağırsak sendromlu (IBS) ve kronik ishalli hastalarda ST3'den sonra en sık ST2 ve ST1'e rastladıklarını bildirmişlerdir. Aynı araştırıcılar bir başka çalışmada, ST2'nin asemptomatik enfeksiyon ile ilişkili Blastocytis alt tipi olduğunu öne sürmüşlerdir23. Yine Doğruman ve arkadaşları, ST3'ün hem semptomatik hem de asemptomatik grupta en sık rastlanan alt tip olduğunu ve Blastocystis alt tipleri ile gastrointestinal semptomlar arasında bir ilişki olmadığını bildirmişlerdir24. Özyurt ve arkadaşlarının25 çalışmasında da, izolatların %75.9'unun ST3 olduğu tespit edilmiş ve alt tiplerle semptomlar arasında ilişki kurulamamıştır. Buna karşın Eroğlu ve arkadaşları17, semptomlu hastaların tamamında ST1 ve semptomsuz grupta ise en fazla ST3 olduğunu bildirmiştir. Alt tipe özgül primerler yüksek özgüllük göstermekle birlikte Blastocystis'in ST1-7 arasındaki alt tiplerini belirleyebilmektedir. Çalışmamızda tiplendirilemeyen 17 (%27.9) izolatın, Tan ve arkadaşlarının26 ifade ettiği gibi, bu yöntemle belirlenemeyen alt tipler olabileceği veya DNA izolasyonundaki sorunlardan kaynaklandığı düşünülmüştür. Benzer olarak Lee ve arkadaşları27, Blastocystis izolatlarının %12.7'sinde ST primerleriyle sonuç alamadıklarını bildirmişlerdir.
Çalışmamızda Blastocystis saptanan olguların çoğunluğunu erkekler (%65.6) oluşturmaktadır. İnceboz ve arkadaşları28 da Blastocystis pozitifliğinin erkekler arasında daha sık görüldüğünü belirtmişlerdir. Ancak çalışmamızdaki gibi Blastocystis pozitif olguların değerlendirildiği bir çalışmada, kadın olgu sayısının daha fazla olduğu rapor edilmiştir29. Engsbro ve arkadaşları30, IBS hastalarında Blastocystis varlığı ve yaş arasında pozitif bir korelasyon olduğunu vurgulamıştır. Bir başka çalışmada ise, çocuk yaş grubunda Blastocystis yaygınlığının daha yüksek olduğu bildirilmiştir31. Çalışmamızda, Blastocystis pozitif olguların %37.7 (23/61)'sinin 1-24 yaş aralığında olduğu görülmüş; 25-49 yaş grubunda bu oran %34.4, 50-75 yaş grubunda ise %22.9 olarak izlenmiştir (Tablo I).
Blastocystis saptanan olguların semptomları değerlendirildiğinde, olgularda en sık karın ağrısı (%39.3) şikayetinin görüldüğü, bunu kaşıntı (%36.1) ve ishalin (%3.3) izlediği belirlenmiştir. Ertuğ ve arkadaşları32, Blastocystis saptadıkları olgularda en sık görülen üç klinik belirtinin; karın ağrısı (%81), karında gaz hissi (%67) ve ishal olduğunu bildirmiştir. Bir diğer çalışmada da benzer şekilde en sık bildirilen semptomlar, sırasıyla karın ağrısı, diyare ve gaz varlığıdır33. Sakalar ve arkadaşları19, karın ağrısı, ishal ve dermatitin en yaygın gözlenen semptomlar olduğunu bildirmiş; Balint ve arkadaşları29 da nedeni bilinmeyen deri lezyonlu hastalarda Blastocystis'in araştırılması gerektiğini ifade etmişlerdir26. Çalışmamızda alt tipi belirlenen olgu sayısının yetersiz olması nedeniyle, alt tipler ve semptomlar arasında istatistiksel analiz yapılamamıştır. Özyurt ve arkadaşları25 Blastocystis enfeksiyonu olan erkek hastalarda en yaygın şikayetin gastroenterit, kadınlarda ise dispepsi olduğunu bildirmiştir. Bizim çalışmamızda, hem erkek hem de kadınlarda en sık rastlanılan şikayet karın ağrısıdır. Dolayısıyla olgularımızda saptanan alt tiplerin ve klinik bulguların, ülkemizde ve dünya genelinde bildirilenler ile benzer olduğu görülmektedir. Sonuç olarak, ülkemizde Blastocystis enfeksiyonlarının epidemiyolojisinin aydınlatılmasında, çok merkezli ve geniş kapsamlı moleküler ve klinik çalışmalara gereksinim olduğu düşünülmüştür.
KAYNAKLAR
İletişim (Correspondence):
Prof. Dr. Sema Ertuğ,
Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi,
Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı,
09010 Aydın, Türkiye.
Tel (Phone): +90 256 212 1850,
E-posta (E-mail): sertug@adu.edu.tr