Yazdır

Uzamış Öksürüğü Olan Çocuklarda Kültür, Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ve
Seroloji ile Bordetella pertussis Enfeksiyonunun Araştırılması*

Detection of Bordetella pertussis Infection by Culture, Real-Time Polymerase Chain Reaction and
Serologic Tests Among Children with Prolonged Cough

Derya GÜRSEL1, Aslı ASLAN2, Cemile SÖNMEZ3, Güldane KOTUROĞLU2, Nilay ÇÖPLÜ3,
Zafer KURUGÖL2, Şöhret AYDEMİR1

1 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir.

1 Ege University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Izmir, Turkey.

2 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı, İzmir.

2 Ege University Faculty of Medicine, Department of Pediatrics, Izmir, Turkey.

3 Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı, Salgın Hastalıklar Araştırma Müdürlüğü, Ankara.

3 Refik Saydam National Public Health Agency, Department of Communicable Diseases Research, Ankara, Turkey.

* Bu çalışma Ege Üniversitesi Rektörlük Araştırma Fon Saymanlığı tarafından desteklenmiştir.

ÖZET

Boğmaca, Bordetella pertussis'in neden olduğu, tüm yaş gruplarını etkileyen, bulaşıcı bir solunum sistemi enfeksiyonudur. Özellikle yenidoğan ve bebeklerde yüksek morbidite ve mortaliteye yol açar. Ergen ve erişkinlerde atipik ve ılımlı seyreden hastalığa çoğu zaman tanı konulamamakta; bu hastalar duyarlı bebek ve çocuklara bulaşmada önemli bir kaynak oluşturmaktadır. Bu nedenle iki haftadan daha uzun süren öksürük semptomu olan çocuk ve ergenlerde B.pertussis enfeksiyonunun laboratuvar incelemeleriyle araştırılması önerilmektedir. Bu çalışmada, uzamış öksürüğü olan çocuk yaş grubu hastalarda kültür, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Rt-PCR) ve serolojik yöntemler ile B.pertussis enfeksiyonunun araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Genel Pediatri Polikliniğine Aralık 2009-Ağustos 2010 tarihleri arasında başvuran, uzamış (≥ 14 gün) öksürüğü olan 2 ay-14 yaş (ortanca: 7.0) arasındaki 51 (19 kız, 32 erkek) hasta dahil edilmiştir. Olguların 48 (%94)'i yaşına uygun olarak aşı şeması uygulanan, üçü ise boğmaca aşısı yapılmamış hastalar olup, 38 (%75) olgunun başvuru öncesinde antibiyotik kullandığı belirlenmiştir. Hastalardan alınan nazofarengeal sürüntü örneklerinde B.pertussis araştırılması için kültür (%7 at kanı ve kömür içeren Bordetella Agar; Becton Dickinson, Almanya) ve IS481 gen bölgesinin hedeflendiği Rt-PCR (Roche Applied Science, Almanya) yöntemleri uygulanmıştır. Ayrıca 2-4 hafta arayla elde edilen iki serum örneğinde antipertussis toksin (anti-PT) IgG ve antifilamentöz hemaglutinin (anti-FHA) IgG düzeylerinin ölçüldüğü "in-house" ELISA çalışılmış; antikor titresinde dört kat artış veya tek serum örneğinde 100 EU/ml'nin üzerindeki anti-PT IgG titreleri B.pertussis enfeksiyonunun serolojik kanıtı olarak kabul edilmiştir. Çalışmaya alınan 51 hastadan birinin nazofarengeal sürüntü kültüründe B.pertussis üremiş; 6 (%11.8) hastanın nazofarengeal sürüntü örneğinde IS481 Rt-PCR testi ile pozitiflik saptanmış ve 9 (%17.6) olgu serolojik testlerle B.pertussis enfeksiyonu olarak değerlendirilmiştir. Buna göre toplam 12 hastada en az bir yöntemle pozitif sonuç alınmış; bu hastalardan birinde her üç yöntemle, ikisinde IS481 Rt-PCR ve serolojik testlerle, üçünde sadece IS481 Rt-PCR ile, altısında ise sadece serolojik testlerle tanı konulmuştur. Dolayısıyla çalışmamızda, uzamış öksürüğü olan çocukların %23.5 (12/51)'inde B.pertussis enfeksiyonu tespit edilmiştir. Bu olguların (5 kız, 7 erkek) yaş aralığı 2 ay-11 yıl arasında olup, biri aşılanmamış, dördü aşı şeması tamamlanmamış hastalardır. Sonuç olarak, uzamış öksürüğü olan çocuklarda B.pertussis varlığının araştırılmasında kültür, PCR ve serolojik testlerin kullanılması gerektiği ve bu alanda standardize edilmiş testlere ihtiyaç olduğu sonucuna varılmıştır.

Anahtar sözcükler: Bordetella pertussis; kültür; seroloji; gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu; uzamış öksürük.

ABSTRACT

Pertussis is a respiratory infection caused by Bordetella pertussis. It attacks all age groups. It has significantly higher mortality and morbidity among newborns and children. Adolescents and adults with symptomatic but unrecognized pertussis are often the source of the infection for pediatric cases. Therefore, it is suggested to perform laboratory diagnostic tests for B.pertussis infection in children and adolescents with prolonged cough of more than two weeks. In this study, it was aimed to identify B.pertussis infection by culture, real-time polymerase chain reaction (Rt-PCR) and serological methods among children with prolonged cough. Nasopharyngeal swab samples were obtained from 51 children (19 female, 32 male; age between 2 months-14 years; median age: 7.0), who attended the outpatient clinic of Ege University Medical Faculty Department of Pediatrics, Izmir, Turkey with prolonged cough (≥ 14 days) during December 2009-August 2010. While pertussis vaccination had been completed in 48 (94%) of the cases, three cases had not been vaccinated. Previous antibiotic treatment was reported for 38 (75%) of the cases. Cultivation was done by using 7% horse blood and charcoal containing Bordetella Agar (Becton Dickinson, Germany) and Rt-PCR targeting IS481 sequence (Roche Applied Science, Germany) was used to detect B.pertussis. In addition, in house ELISA was performed to detect titers of anti-pertussis toxin (anti-PT) IgG and anti-filamentous hemagglutinin (anti-FHA) IgG antibodies in paired sera collected in 2-4 week intervals. Fourfold titer increase of antibodies or anti-PT IgG levels of at least 100 EU/ml in one serum were evaluated as serological confirmation of B.pertussis infection. In our study, B.pertussis was isolated from one nasopharyngeal swab samples culture among the 51 patients, and IS481 Rt-PCR yielded positive results for B.pertussis in 6 (11.8%) samples. Nine (17.6%) patients were diagnosed as B.pertussis infection by serological tests. Totally 12 patients were evaluated as positive using at least one method. Among them only one had positive results with three of the tests used and two were positive with IS481 Rt-PCR assay and serologic tests. Three patients were found positive with only IS481 Rt-PCR and six were identified only with serologic diagnosis. In this study, 23.5% (12/51) of children with persistant cough were evaluated as having B.pertussis infection. The age range of these cases (5 female, 7 male) was 2 months-11 years and one case had not been vaccinated at all while four cases had not completed the vaccination schedule. It was concluded that since B.pertussis can be detected as the etiologic agent of persistant cough in a significant number of children by culture, PCR and serologic tests, diagnostic tests must be applied to evaluate B.pertussis infection. However, standardized serological methods and PCR protocols are needed for accurate and reliable diagnosis.

Key words: Bordetella pertussis; culture; serology; real time polymerase chain reaction; prolonged cough.

Geliş Tarihi (Received): 24.09.2011 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 27.12.2011

GİRİŞ

Boğmaca, Bordetella pertussis'in neden olduğu tüm yaş gruplarını etkileyen bulaşıcı bir solunum sistemi enfeksiyonudur. Özellikle yenidoğan ve bebeklerde yüksek morbidite ve mortaliteye sahiptir. Aşılama programlarının uygulanmaya başlamasından bu yana, hastalığın ortaya çıkış sıklığı ve ölüm oranlarında belirgin düşüş olmuştur1,2. Bununla beraber boğmaca, son 20 yılda yeniden artma eğilimindedir. Aşının sağladığı koruyuculuğun yıllar içinde azaldığı, yaygın aşılama faaliyetinin doğal yoldan oluşan bağışıklamayı engellediği ve böylelikle yaygın aşılamanın olduğu bölgelerde ergen ve erişkinlerin bu hastalığa karşı daha duyarlı hale geldiği savunulmaktadır2,3. Ergen ve erişkinlerde atipik ve ılımlı seyreden hastalığa çoğu zaman tanı konulamamakta; bu hastalar duyarlı bebek ve çocuklara bulaşmada önemli bir kaynak oluşturmaktadır. Bu nedenle iki haftadan uzun süren öksürüğü olan çocuk ve ergenlerde B.pertussis enfeksiyonunun laboratuvar incelemeleriyle araştırılması önerilmektedir1,2,3.

Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi (CDC; Centers for Disease Control and Prevention) tarafından boğmaca olgu tanımları yapılmıştır; ancak boğmaca özellikle ergen ve erişkinlerde tanısı zor konulan bir hastalıktır. Öykü ve fizik muayene bulguları ile tanı konulduğunda birçok olgu yanlış tanımlanmakta ya da atlanmaktadır. Bu nedenle klinik tanının laboratuvar ile doğrulanması önemlidir. Boğmacanın mikrobiyolojik tanısında; kültür, direkt antijen testi, moleküler ve serolojik yöntemler kullanılabilmektedir2,4. Bu çalışmada, uzamış öksürüğü olan 0-18 yaş grubu hastalarda kültür, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Rt-PCR) ve serolojik yöntemlerle B.pertussis enfeksiyonunun araştırılması amaçlanmış; B.pertussis tanı testlerinin rutin laboratuvar çalışmalarına yerleştirilmesi ve boğmaca tanısında kliniklere laboratuvar desteği verilmesi hedeflenmiştir.

GEREÇ ve YÖNTEM

Hastalar ve Örnekler

Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Genel Pediatri Polikliniğine Aralık 2009-Ağustos 2010 tarihleri arasında başvuran, 14 günden uzun süren öksürüğü olan ve öksürüğe sebep olacak başka bir tanısı bulunmayan 0-18 yaş grubu 51 hasta çalışmaya alındı. Başvuru sırasında astım, tüberküloz, kronik bronşit, reaktif hava yolu hastalığı, gastroözefageal reflü hastalığı, anjiyotensin dönüştürücü enzim (ACE) inhibitörü ilaç kullanımı gibi kronik öksürük nedenleri olanlar veya öykü ve fizik muayenede bunlardan şüphelenilen hastalar ile bilinen immünyetmezliği olanlar çalışmaya dahil edilmedi. Çalışma etik kurul onayı ile gerçekleştirildi. Hasta ve hasta yakını çalışma hakkında bilgilendirildi, "bilgilendirilmiş onam formu" hasta yakını tarafından dolduruldu.

Polikliniğe ilk başvuru sırasında hastalardan bir adet nazofarengeal sürüntü (NFS) örneği ve bir serum örneği, 2-4 hafta sonra yine bir serum örneği alındı. NFS, uzman hekim tarafından rayon uçlu, esnek saplı eküvyon (Transwab, İngiltere) ile nostrilden girilip nazofarenks arka duvarında 3-5 saniye rotasyon yapılarak alındı. Kömürlü Amies taşıma besiyerinde (Transwab, İngiltere) birkaç saat içinde Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Bakteriyoloji Laboratuvarına ulaştırıldı. NFS örnekleri kültür ve Rt-PCR testi için kullanıldı. Hastalardan polikliniğe ilk başvuruda ve 2-4 hafta sonra elde edilen serum örnekleri alikotlanarak antipertussis toksin (anti-PT) IgG ve antifilamentöz hemaglutinin (anti-FHA) IgG ELISA testleri uygulanıncaya kadar -80°C'de saklandı.

Kültür ve Direkt Floresan Antikor (DFA) Testi

B.pertussis izolasyonu için NFS örnekleri, "%7 at kanı ve odun kömürü (charcoal) içeren Bordetella Agar (Becton Dickinson, Almanya)" ticari besiyerine ekildi. Plaklar 36°C'de, nemli ortamda, parafilm ile sarılarak 10 gün süreyle inkübe edildi. İnkübasyon süresinde, plaklar şüpheli koloniler açısından her gün kontrol edildi; şüpheli koloniler (üçüncü günden sonra üreyen, yaklaşık 1 mm çaplı, parlak, inci renkli S koloniler) pasajlandı. Bunlardan gram-negatif boyanan ince basil morfolojisine sahip, katalaz pozitif, üreaz negatif, hareketsiz olan ve koyun kanlı agarda üremeyen bakteriler, tanımlama için DFA ve IS481 gen bölgesinin hedeflendiği Rt-PCR testine alındı. Örneklerle eş zamanlı olarak başka bir plağa B.pertussis ATCC 9797 standart suşu pasajlanarak üreme kontrol edildi.

Kültürde üreyen şüpheli kolonilerin tanımlanmasında kullanılan DFA testi, üretici firmanın (Difco FA Bordetella pertussis; Becton Dickinson, ABD) önerilerine göre uygulandı ve değerlendirildi. Testte, kit ile sağlanan FITC ile işaretli poliklonal B.pertussis antikoru kullanıldı. Antiserumun ve yöntemin kontrolü için, pozitif (B.pertussis ATCC 9797) ve negatif (Bordetella parapertussis ATCC 15311 ve Pseudomonas aeruginosa suşları) antijen kontrolleri de test edildi. Pozitif ve negatif kontrol preparatları, NFS örneğinden yapılan kültürde üreyen şüpheli koloniden hazırlanan preparatla eş zamanlı olarak hazırlandı, boyandı ve değerlendirildi.

NFS örnekleri, ekim yapıldıktan sonra 400 µl fosfat tamponu (PBS) içinde süspanse edilip 200 µl'lik iki alikot şeklinde DNA ekstraksiyonunda kullanılmak üzere -80°C'de saklandı.

Gerçek Zamanlı PCR (Rt-PCR) Testi

Daha önce ayrılmış olan 200 µl'lik NFS örneklerinden DNA ekstraksiyonu, "High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Applied Science, Almanya)" ile önerildiği şekilde yapıldı. Elde edilen 200 µl'lik nükleik asit solüsyonunun 5 µl'si amplifikasyona alındı. Her çalışmada negatif kontrol olarak PBS ve pozitif kontrol olarak B.pertussis ATCC 9797 suşunun PBS içindeki süspansiyonu kullanıldı. NFS örneklerinde B.pertussis DNA'sının araştırılması amacıyla B.pertussis için IS481, B.parapertussis için IS1001 gen bölgesinin hedeflendiği kantitatif multipleks Rt-PCR yöntemi uygulandı. Çalışmada "LightCycler FastStart DNA Master HybProbe, Versiyon Ocak 2006 (Roche Applied Science, Almanya) "PCR için "hot start" reaksiyon karışımı ve "LightMix (Bordetella pertussis ve parapertussis) Kit (Roche Diagnostics LightCycler 1.x/2.0 ve 480 II cihazları için) (TIB MOLBIOL GmbH, Almanya)" ticari kitleri kullanıldı.

Kullanılan kit ile B.pertussis için IS481 bölgesinden 130 baz çift (bç)'lik bir bölümün amplifikasyonu yapılmakta, LC640 işaretli hibridizasyon problarıyla saptanmaktadır. B.parapertussis için ise IS1001 bölgesinden 97 bç'lik bir bölümün amplifikasyonu yapılmakta, saptamada LC690 işaretli hibridizasyon probları kullanılmaktadır. İnternal kontrol (İK) LC640 işaretli kısa problarla saptanmakta ve ergime eğrisinde 49.5°C'de pik oluşturmaktadır. Kit içeriğine göre testin duyarlılığı 10 kopya B.pertussis/B.parapertussis DNA'sı; linear ölçüm aralığı ise 102-106 kopya B.pertussis/B.parapertussis DNA'sıdır.

Test için "LightCyler 1.5" cihazı, kit önerisinde belirtildiği şekilde programlandı ve yöntem kit önerilerine uygun olarak çalışıldı. Kit ile sağlanan B.pertussis ve B.parapertussis için 105 hedef molekül/5 µl konsantrasyondaki kontrol DNA'ları, ATCC 9797 suşunun PBS içindeki süspansiyonundan elde edilen DNA ekstraktı ve nükleazdan arındırılmış distile su her çalışmaya dahil edildi. Hasta örneklerinin çalışılmasından önce B.pertussis ATCC 9797 suşu ile hazırlanan 0.5 McFarland bulanıklığındaki bakteri süspansiyonundan 200 µl alınarak DNA ekstraksiyonu yapıldı. Ekstrakte edilen örneğin elüsyon tamponu içinde 10 kat dilüsyonları (7 dilüsyon) hazırlandı. Testin performansının değerlendirilmesi için DNA ekstraktının dilüsyonları Rt-PCR testine alındı.

Amplifikasyon, saptama ve veri analizi "LightCycler 1.5" cihazında gerçekleştirildi. Sonuçlar hedef DNA kopya sayısı olarak elde edildi. Örnekte floresans sinyali yokken internal kontrolde 49.5°C'de pik gözlenmişse ve ekstraksiyon ve amplifikasyon için pozitif kontroller pozitif, negatif kontroller negatif sonuçlanmış ise test sonucu negatif kabul edildi. Negatif kontroller negatif veya pozitif kontroller pozitif olarak sonuçlanmamışsa ya da örnekler negatif olduğu durumda internal kontrolde floresans gözlenmemişse test geçersiz kabul edildi ve tekrarlandı.

Serolojik Testler

Hastaların ilk başvurusunda ve 2-4 hafta sonra elde edilen serum örneklerinde, antipertussis toksin (PT) IgG ve antifilamentöz hemaglutinin (FHA) IgG antikor seviyelerinin saptanması için daha önce standardize edilmiş olan "in-house" kantitatif indirekt ELISA yöntemi kullanıldı5. Düz tabanlı 96 çukurlu mikroplakların (Greiner, Almanya) antijenle kaplanması aşamasında, saflaştırılmış "Pertussis Toxin" ve "Pertussis Filamentous Hemagglutinin" (10'ar µg PN/ampul, Japonya) kullanıldı. Test günü %0.5 sığır serum albumini ile inkübatörde bloke edildi. Plaklar üç kez %0.05 Tween 20 içeren PBS ile yıkandı ve bu işlem her inkübasyondan sonra tekrarlandı. Referans serum ve hasta serumları iki kat artan sekiz seri dilüsyonda hazırlandı ve plaklar bu aşamada ve takip eden aşamalarda 22°C'de bir saat inkübe edildi. Konjugat aşamasında; "Fc-specific alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG" (Seikagaku, Kogyou, Japonya); substrat aşamasında dietanolamin tamponda 1 mg/ml, pH: 9.6 sulandırılmış "P-nitrophenyl phosphate" (Sigma N2765); durdurma aşamasında ise 3M NaOH uygulandı. Mikroplaklar ELISA okuyucusu (Labsystem, Finlandiya) kullanılarak 405/630 nm dalga boylarında okutuldu. Anti-PT ve anti-FHA IgG antikor seviyeleri "paralel line assay" ile boğmaca referans serum (anti-PT için 250 EU/ampul ve anti-FHA için 400 EU/ampul) ile karşılaştırma yapılarak hesaplandı ve ELISA ünitesi/ml (EU/ml) şeklinde ifade edildi. Bu testte saptanabilen en düşük anti-PT ve anti-FHA antikor konsantrasyonu 1.0 EU/ml'dir5,6. İlk serum örneği ile karşılaştırıldığında ikinci serum örneğinde anti-PT IgG ve anti-FHA IgG titresinde dört kat titre artışı ve tek serum örneğinde 100 EU/ml'nin üzerindeki anti-PT IgG titresi seropozitiflik olarak kabul edildi.

BULGULAR

Çalışmaya alınan hastaların 19 (%37)'u kız, 32 (%63)'si erkek olup, yaş aralığı 2 ay-14 yaş (ortanca: 7.0) arasında değişmektedir. Olguların 48 (%94)'i yaşına uygun olarak aşı şeması uygulanmış, üçü ise boğmaca aşısı yapılmamış hastalar olup, 38 (%75)'inin başvuru öncesinde antibiyotik kullanım öyküsü vardır (Tablo I). Uzamış öksürüğü olan hastaların polikliniğe başvurularına kadar olan öksürük süreleri 15-180 gün arasındadır (Tablo I).


Tablo I

Çalışılan 51 hastaya ait NFS örneklerinden 1 (%1.96)'inde kültür, 6 (%11.8)'sında ise IS481 Rt-PCR pozitifliği saptanmıştır (Tablo I). Serolojik tanı için 31 (%61) hastadan 2-4 hafta arayla çift, 20 (%39) hastadan ise tek serum örneği alınabilmiş ve 9 (%17.6) olguda serolojik testlerde pozitiflik belirlenmiştir (Tablo I). Toplam 12 (%23.5) hastada en az bir yöntemle pozitiflik tespit edilmiştir (Tablo II).


Tablo II

B.pertussis ATCC 9797 suşundan elde edilen DNA örneğinin IS481 Rt-PCR amplifikasyon eğrileri, ürünlerin "crossing point" ve konsantrasyonları Resim 1'de gösterilmiştir. P.aeruginosa DNA süspansiyonu (negatif kontrol), amplifikasyona alındığında negatif sonuç vermiştir (Resim 1).


Resim 1

Başvuru sırasında 30 günden kısa süredir öksürük semptomu olan 15 hastanın birinde her üç yöntemle pozitiflik saptanmıştır. İki olguda IS481 Rt-PCR ve seroloji pozitifliği, üçünde sadece IS481 Rt-PCR, birinde ise sadece seroloji pozitifliği belirlenmiştir. Öksürük semptomunun 30-60. gününde başvuran 17 hastanın dördünde sadece serolojik testlerde pozitiflik izlenmiştir. Polikliniğe başvuru sırasında 60 gün ve daha uzun süredir öksürüğü olan 19 olgunun ise sadece birinde seroloji pozitifliği görülmüştür. B.pertussis enfeksiyonu yönünden yapılan mikrobiyolojik çalışmalarda, pozitiflik saptanan 12 (5 kız, 7 erkek) olgunun yaş aralığı 2 ay-11 yaş (ortanca: 6.5) arasındadır. B.pertussis enfeksiyonu olan olguların Aralık 2009-Ağustos 2010 tarihleri arasında aylara göre dağılımları Şekil 1'de görülmektedir.


Şekil 1

TARTIŞMA

B.pertussis enfeksiyonunun mikrobiyolojik tanısı; kültür, DFA ile antijen saptama, PCR ve serolojik yöntemlerle yapılmaktadır. DFA testi, hızlı, ucuz ve basit bir yöntem olmakla birlikte özgüllük ve duyarlılığı (%30-71) düşüktür7. Değerlendirmenin subjektif olması, yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçlar ile sık karşılaşılması gibi nedenlerle CDC, DFA testinin kullanımını önermemekte, kullanılırsa mutlaka kültürle birlikte yapılması gerektiğini vurgulamaktadır7,8. Birçok ülkenin sürveyans sisteminde DFA, B.pertussis enfeksiyonunun laboratuvar kanıtı olarak kabul edilmemektedir1. Bu kısıtlamalar nedeniyle çalışmamızda DFA testi, sadece kültürde üreyen şüpheli bakterilerin tanımlanmasında kullanılmıştır.

Kültür ve PCR ile B.pertussis araştırılmasında, bakterinin tutunduğu üst solunum yolunun siliyalı epitelini içeren nazofarengeal aspirat veya nazofarenks arka duvarı sürüntüsü tercih edilen örneklerdir. Boğaz sürüntüsü, burun sürüntüsü ve balgam, siliyalı epiteli içermediğinden ve çok sayıda normal flora üyesi bulundurduğundan uygun örnekler değildir. NFS örneğinin alınması invaziv değildir ve rutin kullanım için pratiktir. Bu çalışmada çocuk yaş grubu poliklinik hastaları hedeflendiğinden, hasta uyumunun daha iyi olduğu NFS örnekleri tercih edilmiştir. NFS, esnek tel saplı, dakron ya da rayon uçlu eküvyon ile alındığında hem kültür hem de nükleik asit testi için uygun örnektir. Pamuk uçlu eküvyonların içerdikleri yağ asitleri nedeniyle B.pertussis kültürü için inhibitör olması; kalsiyum aljinat uçlu eküvyonların ise PCR'yi inhibe etmesi nedeniyle, bu çalışmada rayon uçlu esnek tel saplı eküvyonlar kullanılmıştır4,7,9. Uygulanan PCR testinde hiçbir örnekte inhibisyona rastlanmamıştır.

Kültür, B.pertussis enfeksiyonu tanısında en özgül yöntem olarak kabul edilmektedir; ancak duyarlılığı düşüktür. Yapılan çalışmalarda kültürün duyarlılığı, hastanın semptomlarının süresi, yaşı, aşılanma durumu, antibiyotik kullanımı gibi faktörlere, örnek alım ve transport koşullarına ve kullanılan besiyerine bağlı olarak değişmektedir7. Öksürük semptomunun ilk iki haftasında etkenin kültürde izolasyon oranları daha yüksektir. Ancak tipik hastalık tablosu yerleştiğinde bu oranlar düşer. Yapılan farklı çalışmalarda kültürün duyarlılığı için %12-60 arasında değişen oranlar bildirilmiştir10. B.pertussis izolasyonu için Bordet-Gengou ve Regan-Lowe agar sıklıkla kullanılan besiyerleridir. Ancak Regan-Lowe besiyerinin raf ömrü daha uzundur ve bakterinin izolasyon oranlarını artırdığı gösterilmiştir11. Bu çalışmada, NFS örneklerinin kültüründe, %7 at kanı ve kömür içeren ticari Bordetella Agar (Becton Dickinson GmbH) kullanılmıştır. Bu besiyeri, Mishulow ve arkadaşlarının12 formülü baz alınarak hazırlanmış Regan-Lowe agar benzeri bir besiyeridir ve normal flora elemanlarının baskılanması için 0.04 g/L sefaleksin içerir. Besiyeri ve ortam şartlarının kontrolü için kullanılan B.pertussis standart suşu, bu besiyerinde sorunsuz olarak üremiştir. Çalışmada, örnek akışının yavaş olduğu göz önüne alındığında, besiyerinin iki ay olan raf ömrü avantaj sağlamıştır. Klinisyenin katılımını gerektireceğinden örnekler hasta başında ekilmemiş; kömürlü Amies taşıma besiyerinde birkaç saat içinde laboratuvara ulaştırılıp hemen kültür yapılmıştır.

Çalışmamızda, hastaların %23.5 (12/51)'inde en az bir test ile pozitiflik saptanmış, 1 (%2) hastanın kültüründe ise B.pertussis üremiştir. Çalışmaya alınan olguların 15 günden uzun süredir semptomları olan, çoğu aşılı ve başvuru öncesinde antibiyotik almış hastalar olduğu göz önüne alındığında (sadece dört hasta 20 günden daha kısa süredir semptomu olan ve antibiyotik almamış olgulardır), bu oran kabul edilebilir. B.pertussis izole edilen hasta ise üç doz aşılanmış, ancak boğmaca aşı şeması tamamlanmamış, 20 gündür öksürüğü olan 10 aylık bir olgudur. Bu hastada PCR ve serolojik testler de pozitif bulunmuştur.

B.pertussis enfeksiyonunun moleküler tanısında, farklı gen bölgelerini hedefleyen PCR yöntemlerinin arasında Rt-PCR yöntemi, kontaminasyonu en aza indiren kapalı sistem olması, DNA ekstraksiyonu sonrası kısa sürede sonuç vermesi, özgül problarla yakalanan yüksek özgüllük ve duyarlılık oranlarıyla öne çıkmıştır13. Kültürde olduğu gibi PCR'nin duyarlılığı da, semptomların başlangıcından itibaren geçen süre uzadıkça azalmaktadır. Ancak kültürden farklı olarak ölü bakterilerin DNA'sının saptanabilmesi nedeniyle PCR ile nazofarengeal örneklerde dört haftadan sonra da B.pertussis DNA'sı gösterilebilmektedir14. Antibiyotik tedavisinden sonra da PCR pozitifliği kültüre göre daha uzun süre devam etmektedir. Bidet ve arkadaşları14, boğmaca için antibiyotik tedavisi verilen 22 hastanın seri nazofarengeal aspirat örneklerinde B.pertussis DNA'sının persistansını araştırmışlar; izlemde ulaşılabilen hastalarda, tedavinin başlangıcından itibaren beşinci günde 21/21, 14. günde 10/12, 21. günde 4/6 ve 30. günde 1/1 hastada Rt-PCR pozitifliği saptamışlardır. Bu hastaların 11'inin başlangıç kültürlerinde B.pertussis üremesi varken, 5-14. günde tekrarlanan kültürleri negatifleşmiştir.

B.pertussis araştırılmasında genomda sıklıkla kullanılan iki hedef IS481 ve pertussis toksin promoter gen bölgeleridir15,16. Daha duyarlı olması nedeniyle tercih edilen IS481'i hedefleyen primerlerin, aynı zamanda Bordetella holmesii'yi de saptaması, bu bölgenin özgüllüğünün sorgulanmasına neden olmaktadır. Ancak, boğmaca benzeri öksürüğü olan hastalarda nazofarengeal örneklerde B.holmesii ya nadiren izole edilmiş ya da hiç saptanmamıştır17. "Pertussis Consensus Group" tarafından 2005 yılında, boğmaca tanısında nükleik asit amplifikasyon testlerinin kullanımı ile ilgili yayınlanan önerilerde; toplumda solunum yolu enfeksiyonlarında B.holmesii insidansı çok düşük olduğundan, hastanın semptomları uyumlu ise, rutinde klinik örnekteki IS481 PCR pozitifliğinin B.pertussis enfeksiyonu olarak değerlendirilebileceği belirtilmektedir18. Ayrıca yapılan çalışmalar, IS481 gen bölgesini hedefleyen PCR testlerinin analitik özgüllüğünün yüksek olduğunu göstermektedir13,15. Yine de Rt-PCR yöntemlerinin uygulanmasında, kalite kontrol önerilerine titizlikle uyulması ve testin performansının değerlendirilmesinde pozitif kontrol olarak standart suşların kullanılması gerekliliği vurgulanmaktadır13,15,18. Bizim çalışmamızda da kontrol olarak B.pertussis ATCC 9797 kullanılmıştır.

Nazofarengeal sürüntü örneklerinde DNA ekstraksiyonu sonrası IS481 gen bölgesinin araştırılmasında kullanılan kit, aynı zamanda B. parapertussis DNA'sını da saptayan multipleks Rt-PCR formatındadır. Bu çalışmada B.parapertussis araştırılması hedeflenmemiş, ancak mevcut ticari kit olması nedeniyle bu kit tercih edilmiştir. Çalışmaya alınan örneklerde B.parapertussis için PCR pozitifliği saptanmamıştır. Çalışmamızda, 6 (%11.8) hastada Rt-PCR pozitifliği belirlenmiş; bunlardan birinde aynı zamanda kültür ve serolojiyle de pozitiflik saptanırken, ikisinde PCR ve seroloji pozitif bulunmuştur. Kalan üç olguda ise sadece IS481 Rt-PCR pozitifliği saptanmıştır. Çalışmamızın verileri, IS481 PCR'nin duyarlılığının (%93) kültüre göre (%58) daha üstün olduğunu rapor eden Dragsted ve arkadaşlarının19 çalışmasıyla uyumludur. Ayrıca, literatürle uyumlu olarak, PCR pozitifliği saptanan olguların19 çoğu aşı şeması tamamlanmamış ve semptomların başlangıcından örnek alınmasına kadar geçen süre daha az olan hastalardır19,20.

Boğmacaya karşı koruyucu antikor seviyesi henüz belirlenmemiş olmasına karşın, PT ve FHA'ya karşı 10 EU/ml düzeyindeki titreleri koruyucu olarak kabul eden çalışmalar mevcuttur20,21,22. Bu çalışmada anti-PT IgG ve anti-FHA IgG titresinde dört kat artış ve tek serum örneğinde 100 EU/ml'nin üzerindeki anti-PT IgG titreleri B.pertussis enfeksiyonunun serolojik kanıtı olarak değerlendirilmiştir. Anti-PT antikorları B.pertussis'e özgüldür; ancak farklı bakteriyel enfeksiyonlar, FHA ile çapraz reaksiyon veren antikorların gelişmesine neden olabilir23. B.pertussis ile enfekte bireylerin %90'dan fazlasının her iki antijenik yapıya karşı antikor geliştirdiği bilinmektedir9. Çalışmamızda, serolojik tanı pozitifliği olan hastaların çoğunda, birinci ve ikinci serum örnekleri arasında anti-PT IgG ile paralel olarak anti-FHA IgG antikorlarında da artış görülmüştür. Hastaların 9 (%17.6)'u serolojik olarak B.pertussis enfeksiyonu olarak değerlendirilmiş; bunların üçünde (15-20 gündür öksürük semptomu olan olgular) aynı zamanda Rt-PCR pozitifliği de saptanmıştır. Başvuru sırasında 30-60 gündür öksürük semptomu olanlarda saptanan pozitiflikler değerlendirildiğinde, beş hastada ve sadece serolojik olarak B.pertussis enfeksiyonunun saptanması, özellikle hastalığın ilerleyen dönemlerinde serolojinin PCR'ye üstün olduğunu yönündeki literatür bilgisiyle paraleldir10,24. Ankara'da 2007 yılında yapılan bir çalışmada25 14 günden uzun süren öksürüğü olan 6-14 yaş grubu çocuklarda anti-PT IgG ELISA ile boğmaca sıklığı araştırılmış ve 307 öğrencinin %16.6'sında B.pertussis enfeksiyonu saptanmıştır. Yıldırım ve arkadaşlarının26 çalışmasında da, 0-16 yaş grubu uzamış öksürüğü (≥ 14 gün) olan çocuklarda; kültür, IS481 gen bölgesini hedefleyen konvansiyonel PCR ve anti-PT IgA ve IgG ELISA yöntemleri kullanılarak boğmaca sıklığı araştırılmıştır. Bir yıllık dönemde, olguların %16.9 (25/148)'unda en az bir yöntemle pozitiflik belirlenmiş; 12 olguda sadece PCR, dokuz olguda sadece seroloji, dört olguda ise hem PCR hem de seroloji ile pozitiflik izlenmiş; kültür pozitifliği saptanmamıştır26.

Hastalığın serolojik tanısı, çift serum örneği arasında serokonversiyonun gösterilmesiyle konulmaktadır2. Bu uygulama, zaman alıcı olmasının yanı sıra, hastaların ikinci başvurusunun her zaman sağlanamaması ya da ilk başvurunun geç dönemde yapılması gibi nedenlerden dolayı pratik değildir. Çalışmamızda, tüm hastalardan (n= 51) ilk serum örnekleri ilk poliklinik başvurusu sırasında alınmış; ancak ikinci serum örnekleri ancak 31 hastadan elde edilebilmiştir. Hastaların şehir dışında olmaları, semptomlarının kaybolması ve özellikle bebeklerde, tekrar kan alma işlemi konusunda ailenin direnç göstermesi gibi nedenler ikinci serum örneklerinin elde edilmesini zorlaştırmıştır. Bu nedenle çalışmamızda, başka çalışmalarda27 belirtildiği şekilde, tek serum örneğindeki 100 EU/ml'nin üzerindeki anti-PT IgG titreleri de B.pertussis enfeksiyonunun kanıtı olarak değerlendirilmiştir. IS481 Rt-PCR pozitifliği olan üç hastada, ikinci serum örnekleri alınamadığından olası bir titre artışı araştırılamamıştır (Tablo II). Bu hastalar 15-20 gündür öksürüğü olan hastalardır. Dolayısıyla, özellikle hastalığın erken döneminde, tek serum örneğinin yeterli olmayabileceği kanısına varılmıştır. Seroloji ve PCR için optimal örnek alma zamanları farklı olduğundan bu iki testin sonuçlarının tam olarak uyumu beklenmemektedir28. Çalışmadan elde edilen sonuçlar da bu yöndedir. Öksürüğün başlangıcından itibaren üç hafta içinde örnek alındığında kültür ve özellikle PCR ile; üç hafta sonrasında, büyük çocuk ve erişkinlerde ise seroloji ile tanı konulması daha olası görünmektedir.

Çalışmamıza, Aralık 2009-Ağustos 2010 tarihleri arasındaki dokuz aylık dönemde başvuran hastalar alınmıştır. B.pertussis enfeksiyonu en fazla ilkbahar sonu ve yaz aylarında başvuran hastalarda saptanmış, kış aylarında başvuran hiçbir hastada izlenmemiştir. Literatürde de yaz ve sonbahar aylarında olguların sıklığında artış olduğu bildirilmektedir4,19.

Ege bölgesi genelinde 2005 yılı verilerine göre boğmaca aşılanma oranı %93'tür. Aynı yıl Ege bölgesinde bildirilen olgu sayısı 42 ve insidans 0.44/100.000'dir29. Bu çalışmaya dahil edilen hastaların aşılama oranı ise %94 olarak hesaplanmıştır. Ancak bu çalışmanın ve ülkemizde yapılan benzer çalışmaların sonuçları, yüksek aşılama oranlarına rağmen B.pertussis'in toplumda dolaşmaya devam ettiğini göstermektedir25,26,30. Uzamış öksürüğü olan çocuk yaş grubunda kültür, PCR ve serolojik yöntemler kullanıldığında, etken olarak B.pertussis önemli oranda saptanmaktadır. Kültür, duyarlılığı düşük ve geç sonuç veren bir yöntem olduğundan, özellikle semptomların ilk üç haftasında PCR yönteminin, daha geç dönemde ise serolojinin tanıya önemli katkıda bulunduğu söylenebilir. Ancak bu alanda standardize PCR protokollerine ve serolojik yöntemlere gereksinim vardır.

KAYNAKLAR

  1. Waters V, Halperin S. Bordetella pertussis, pp: 2955-64. In: Mandell GL, Bennet JE, Dolin R (eds), Mandell, Douglas and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases. 2010, 7th ed. Churchill Livingstone Elsevier, Philadelphia.
  2. Cherry DJ, Grimprel E, Guiso N, Heininger U, Mertsola J. Defining pertussis epidemiology: clinical, microbiologic and serologic perspectives. Pediatr Infect Dis J 2005; 24 (Suppl 5): 25-35. [Özet]
  3. Kurugöl Z. Türkiye'de boğmaca epidemiyolojisi: Pekiştirme aşı dozları gerekli mi? Çocuk Enf Derg 2009; 3(1): 14-8. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  4. Mattoo S, Cherry JD. Molecular pathogenesis, epidemiology, and clinical manifestations of respiratory infections due to Bordetella pertussis and other Bordetella subspecies. Clin Microbiol Rev 2005; 18(2): 326-82.
    [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  5. Coplu N, Esen B, Kurtoglu D, Gozalan A, Miyamura K, Yoshida I. Standardization of an in-house ELISA for pertussis serology and its application in a seroepidemiological study. Mikrobiyol Bul 2005; 39(3): 281-289. [Özet] [PDF]
  6. Vatansever U, Coplu N, Oner N, et al. Seroprevalence of Bordetella pertussis antibodies among healthy adolescent girls in Edirne. Swiss Med Wkly 2005; 135(35-36): 531-6. [Özet] [PDF]
  7. Birinci A. Bordetella, s: 803-13. Başustaoğlu A (çeviri ed.), Klinik Mikrobiyoloji. 2009, 9. Baskı. Atlas Kitapçılık, Ankara.
  8. Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for the control of pertussis outbreaks. 2000, CDC. Atlanta, GA.
  9. Winn WC, Allen SD, Janda WM, et al (eds), Bordetella species, pp: 510-23. Koneman's Color Atlas and Diagnostic Microbiology. 2006, 6th ed. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia.
  10. Wendelboe AM, Van Rie A. Diagnosis of pertussis: a historical review and recent developments. Expert Rev Mol Diagn 2006; 6(6): 857-64. [Özet]
  11. Morril WE, Barbaree JM, Fields BS, Sanden GN, Martin WT. Effects of transport temperature and medium on recovery of Bordetella pertussis from nasopharyngeal swabs. J Clin Microbiol 1988; 26(9): 1814-7. [Özet] [PDF]
  12. Mishulow L, Sharpe LS, Cohen LL. Beef-heart charcoal agar for the preparation of pertussis vaccines. Am J Public Health Nations Health 1953; 43(11): 1466-77. [PDF]
  13. Kösters K, Reischl U, Schmetz J, Riffelmann M, Wirsing von König CH. Real time LightCyler PCR for detection and discrimination of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis. J Clin Microbiol 2002; 40(5): 1719-22.
    [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  14. Bidet P, Liguori S, De Lauzanne A, et al. Real-time PCR measurement of persistance of Bordetella pertussis DNA in nasopharyngeal secretions during antibiotic treatment of young children with pertussis. J Clin Microbiol 2008; 46(11): 3636-8. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  15. Sloan LM, Hopkins MK, Mitchell PS, et al. Multiplex LightCycler PCR assay for detection and differentiation of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis in nasopharyngeal specimens. J Clin Microbiol 2002; 40(1): 96-100.
    [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  16. Knorr L, Fox JD, Tilley PA, Ahmed-Bentley J. Evaluation of real-time PCR for diagnosis of Bordetella pertussis infection. BMC Infect Dis 2006; 6: 62. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  17. Antila M, He Q, de Jong C, et al. Bordetella holmesii DNA is not detected in nasopharyngeal swabs from Finnish and Dutch patients with suspected pertussis. J Med Microbiol 2006; 55(Pt 8): 1043-51. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  18. Riffelmann M, Wirsing von König CH, Caro V, Guiso N; Pertussis PCR Consesus Group. Nucleic acid amplification tests for diagnosis of Bordetella infections. J Clin Microbiol 2005; 43(10): 4925-9. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  19. Dragsted DM, Dohn B, Madsen J, Jensen JS. Comparison of culture and PCR for detection of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis under routine laboratory conditions. J Med Microbiol 2004; 53(Pt 8): 749-54.
    [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  20. Holberg-Petersen M, Jenum PA, Mannsaker T, Melby KK. Comparison of PCR with culture applied on nasopharyngeal and throat swab specimens for detection of Bordetella pertussis. Scand J Infect Dis 2011; 43(3): 221-4. [Özet]
  21. World Health Organization. Immunological basis for immunization. Module 4: Pertussis WHO/EPI/GEN/98.14.
  22. Konda T, Kamachi K, Iwaki M, Matsunaga Y. Distribution of pertussis antibodies among different age groups in Japan. Vaccine 2002; 20(13-14): 1711-7. [Özet]
  23. Vincent JM, Cherry JD, Nauschuetz WF, et al. Prolonged afebrile nonproductive cough illnesses in American soldiers in Korea: a serological search for causation. Clin Infect Dis 2000; 30(3): 534-9. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  24. Birkebaek NH, Kristiansen M, Seefeldt T, et al. Bordetella pertussis and chronic cough in adults. Clin Infect Dis 1999; 29(5): 1239-42. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  25. Aksakal FN, Coplu N, Ceyhan MN, et al. High incidence of pertussis among schoolchildren with prolonged cough in Turkey. Tohoku J Exp Med 2007; 211(4): 353-8. [Özet]
  26. Yildirim I, Ceyhan M, Kalayci O, et al. Frequency of pertussis in children with prolonged cough. Scand J Infect Dis 2008; 40(4): 314-9. [Özet]
  27. Giammanco A, Chiarini A, Maple PA, et al. European Sero-Epidemiology Network: standardisation of the assay results for pertussis. Vaccine 2003; 22(1): 112-20. [Özet]
  28. Fry NK, Tzivra O, Li YT, et al. Laboratory diagnosis of pertussis infections: the role of PCR and serology. J Med Microbiol 2004; 53(Pt 6): 519-25. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  29. Dilli D, Bostanci I, Dallar Y, Buzgan T, Irmak H, Torunoglu MA. Recent findings on pertussis epidemiology in Turkey. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2008; 27(5): 335-41. [Özet]
  30. Esen B, Coplu N, Kurtoglu D, Gozalan A, Akin L. Prevalence of high antibody titers of pertussis in Turkey: reflection of circulating microorganism and a threat to infants. J Clin Lab Anal 2007; 21(3): 154-61. [Özet]

İletişim (Correspondence):

Uzm. Dr. Derya Gürsel,

Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

Bornova, 35100 İzmir, Türkiye.

Tel (Phone): +90 232 390 3303,

E-posta (E-mail): deryagursel@gmail.com

Yazdır