Yazdır

Vero ve HeLa Hücrelerinde Eş-Kültür ile Elde Edilen Bartonella henselae Antijenlerinin
İndirekt İmmünofloresan Antikor Yöntemindeki Performanslarının Karşılaştırılması

Comparison of the Indirect Immunofluorescence Assay Performance of Bartonella henselae
Antigens Obtained by Co-Cultivation in Vero and HeLa Cells

Çağrı ERGİN1, Yüksel AKKAYA1, Özgün KİRİŞ SATILMIŞ1, Cansev YILMAZ2

1 Pamukkale Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Denizli.

1 Pamukkale University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Denizli, Turkey.

2 SB Kars Devlet Hastanesi, Kars.

2 Kars State Hospital, Kars, Turkey.

ÖZET

Bartonella henselae enfeksiyonunun laboratuvar tanısı indirekt immünofloresans antikor (IFA) ile yapılan serolojik testlere dayanır. B.henselae'nın hücre dizilerindeki eş-kültürleri ve agar ortamlarında üretilen antijenleri, anti-Bartonella antikorlarının değerlendirilmesinde kullanılan iki ana yöntemi oluşturur. Vero ve Hep-2 hücre kültürü serileri, hem laboratuvarda hazırlanan hem de ticari olarak temin edilebilen tanısal kitlerin oluşturulmasında eş-kültür için en sık kullanılan ortamlardır. Bununla birlikte daha kolay sağlanabilen ve üretilebilen HeLa hücreleri de B.henselae ile kolaylıkla enfekte olabilir. Bu çalışmada, B.henselae ATCC 49882 (Houston-1) suşu ile eş-kültürü yapılan Vero ve HeLa hücrelerinden elde edilen antijenlerin, IFA yöntemi ile antikor tespitindeki performanslarının karşılaştırılması amaçlanmıştır. Çalışmamızda, her iki hücre dizisi eş-kültürü antijenleri ile çalışılan IFA yönteminde; 381 serum örneğinin 127 (%33.3)'si pozitif, 195 (%51.2)'i negatif bulunmuş; yöntemler arası toplam uyum %84.5 (322/381) olarak belirlenmiş ve uyumun değerlendirilmesinde Cohen kappa değeri 0.68 (güçlü, tutarlı) olarak hesaplanmıştır. Sonuç olarak, B.henselae enfeksiyonlarının serolojik tanısı için IFA yönteminde HeLa hücrelerinden elde edilen B.henselae antijenlerinin kullanılması yararlı olabilir. HeLa hücrelerinde eş-kültür yönteminin rutin uygulamaya girmesinden önce, farklı genotipteki suşlarla ve diğer enfeksiyöz etkenler ile çapraz reaksiyonların olup olmadığı, planlanacak yeni çalışmalar ile araştırılmalıdır.

Anahtar sözcükler: Bartonella henselae; eş-kültür; immunofloresans antikor yöntemi; HeLa; Vero; seroloji.

ABSTRACT

The laboratory diagnosis of Bartonella henselae infection is mainly based on serological testing by indirect immunofluorescence assay (IFA). Cell line co-cultivation with B.henselae and agar derivated antigens are the two major procedures used for evaluation of anti-Bartonella antibodies. Vero and Hep-2 cell lines are the most commonly used media for co-cultivation both in-house and commercial diagnostic kits production. However, HeLa cells which are easily supplied and grown, also can easily be infected by B.henselae. The aim of this study was to compare the performances of antigens obtained by co-cultivation of B.henselae ATCC 49882 (Houston-1) in Vero and HeLa Cells in IFA serology. Out of 381 sera samples, 127 (33.3%) were found positive and 195 (51.2%) were found negative by IFA performed by both cell line co-cultivations. The total agreement between the methods were found as 84.5% (322/381), and Cohen kappa value was calculated as 0.68 (strong, coherent). As a result, HeLa cells were found to be useful for the preparation of B.henselae antigens to be used in IFA for the serologic diagnosis of B.henselae infections. However different genotype strains and cross reactions with other infectious agents should be investigated by further studies before routine applications of HeLa cell co-cultivations procedure is established.

Key words: Bartonella henselae; co-cultivation; immunofluorescence antibody method; HeLa; Vero; serology.

Geliş Tarihi (Received): 14.01.2011 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 05.04.2011

GİRİŞ

Bartonella türleri, besiyerlerinde zor üreyen, gram-negatif, aerobik basillerdir1,2. Bartonella enfeksiyonları sırasında mikrobiyolojik tanı koymak güçtür; zira etkenin primer izolasyonu 2-6 haftalık inkübasyonu gerektirmektedir. Enfeksiyon varlığında bile, kan ve lenf nodu biyopsisi gibi klinik örneklerden izolasyonun başarılması zordur. Erken laboratuvar testi olarak kullanılabilen intradermal deri testi %99 özgüllüğe sahiptir, ancak pratik değildir. Foliküler hiperplazi ve mikroapse odakları ile birlikte granülom formasyonu histopatolojik olarak Bartonella henselae'yi düşündürür. Warthin-Starry gümüşleme boyası ile tanı desteklenir. İnvazif girişim ihtiyacı nedeniyle patolojik tanı kolaylıkla uygulanamaz3,4,5. B.henselae enfeksiyonunun tanısında PCR temelli testler günceldir, ancak duyarlılığı %43-76 arasında değişmektedir5.

Günümüzde serolojik yöntemler [indirekt immünofloresans antikor (IFA), enzim temelli immünolojik yöntemler (EIA), immunoblot yöntemleri vb.] kolay uygulanabilir olması, invazif işlem gerektirmemesi ve kısa sürede sonuç vermesi gibi avantajları nedeniyle bartonelloz tanısında önem kazanmıştır. Bu yöntemlerin duyarlılığı; yöntemin mekanizmasına, kullanılan antijenlerin farklılığına, testin uygulama şekline ve kullanılan eşik (cut-off) değerine göre farklılık göstermektedir. IFA tekniği ile yapılan araştırmalarda, duyarlılık %14-100, özgüllük %0-100 arasında bildirilmektedir6. Ticari olarak üretilen IFA kitlerinde antijenler farklı yöntemlerle ve farklı hücre kültürlerinde hazırlanmaktadır. Vero [Afrika yeşil maymun (Cercopithecus aethiops) böbrek epitel hücreleri] ve Hep-2 (insan epiteloid larenks karsinoma) hücreleri en yaygın kullanılan hücre kültürleridir. Ticari kitlerin karşılaştırmalı değerlendirmesinde genel olarak kabul edilen görüş, kullanılan testlerin yüksek özgüllüğe, ancak düşük duyarlılığa sahip olmasıdır7,8,9,10,11. IFA testi ayrıca, besiyerinde üretilen bakterilerin yumurta sarısında emülsiyonu yöntemi ile elde edilen antijenlerle de uygulanabilmektedir12,13. Ancak petri plaklarındaki agar yüzeyinde üretilen B.henselae, sıvı ortamda otoaglütinasyon yapma eğilimindedir. Bu nedenle intraselüler üreyebilen B.henselae, hücre kültürü serilerinde eş-kültür (ko-kültüvasyon) ile çoğaltılır ve IFA tekniğinde kullanılacak olan lamlara kaplanır14.

Ticari olarak bulunabilen tanı kitlerinde, popülasyon taramalarında ve laboratuvar ortamında hazırlanan tanısal işlemlerde Hep-2 ve Vero hücrelerinde eş-kültürünün yapıldığı antijen hazırlama işlemi, IFA tekniği için en sık kullanılan yöntemdir. Ancak ülkemizde insan servikal karsinoma hücre serisi olan HeLa hücreleri (Henrietta Lacks servikal kanser hücreleri) birçok laboratuvar ortamında bulunmakta, ticari olarak kolaylıkla sağlanabilmektedir. HeLa hücrelerinin de B.henselae ile kolaylıkla enfekte olabildiği patogenez çalışmaları ile gösterilmiştir15,16. Sunulan araştırmada, B.henselae bakterisi standart yöntemler kullanılarak HeLa ve Vero hücrelerinde eş-kültür ile çoğaltılmış, IFA tekniği ile antikor saptama oranları karşılaştırılmıştır.

GEREÇ ve YÖNTEM

Çalışmaya tıbbi etik kurul tarafından B.henselae'ye karşı antikor varlığının araştırılmasına onay verilen 381 serum örneği alındı. Antijenlerin hazırlanmasında Regnery ve arkadaşları17 tarafından önerilen yöntem uygulandı. Tip II güvenlik kabini içinde, liyofilize B.henselae ATCC 49882 (Houston-1) suşu steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile süspanse edildi. Bakteri süspansiyonu taze olarak hazırlanmış %5 defibrine at kanlı beyin-kalp infüzyonu (BKI) agar besiyerlerine ekildi. Ekim yapılan besiyerleri nem ve %10 CO2 sağlayan etüvde 45 gün inkübe edildi. B.henselae'nın Vero ve HeLa hücre kültürlerine eş-kültürü Zbinden ve arkadaşları14 tarafından belirtilen şekilde yapıldı. Hücrelerin tek tabaka oluşumu sağlandıktan sonra, %5 at kanlı BKI agar besiyerinde canlandırılmış olan B.henselae suşu, BKI buyyonu ile süspanse edildi. Hazırlanmış bakteri süspansiyonundan 100 µl alınarak tek tabaka halinde hücre içeren 25 cm3'lük "flask"lar içine inoküle edildi. Hücreler 37°C'de %10'luk CO2 ve nem sağlayan etüvde yaklaşık bir hafta inkübasyona bırakıldı. Teflon kaplı lamlar %96'lık etanol içeren şale içinde 10 dakika bekletildi. Hava akımı altında kurutulan lamlar kullanıma hazır hale getirildi. İnkübasyonda bırakılmış hücreler Tip II güvenlik kabini içinde steril Pasteur pipeti yardımıyla steril cam tüplere alındı. Yılmaz ve arkadaşlarının18 tanımladığı şekilde, cam tüp içerisine alınan B.henselae ile enfekte hücreler, su banyosunda 56°C'de 30 dakika bekletilerek B.henselae antijenlerinin inaktivasyonu sağlandı18. Güvenlik kabininde 100 µl'lik pipet yardımıyla inaktive edilmiş antijen süspansiyonundan 10'ar µl alınarak, her birinde on kuyucuk bulunan teflon kaplı lamlar üzerine konuldu. Lamlar hava akımı yardımıyla oda ısısında kurumaya bırakıldı. Kurutulmuş olan lamlar -20°C soğutulmuş aseton içerisinde 15 dakika bekletilerek antijenler tespit edildi ve çalışma süresine kadar -70°C'de saklandı.

Çalışma kapsamına alınan 381 serum örneği için Regnery ve arkadaşlarının17 tanımladığı protokol uygulandı. Tween 20 (%1) içeren PBS ile yağı alınmış süt tozundan %5'lik çalışma solüsyonu hazırlandı. Serum örnekleri oda ısısında çözüldükten sonra vorteks ile süspanse edildi. Her iki hücre kültürü serisinden hazırlanan antijenlerle kaplanmış lamlar üzerinde, serum örneklerinin 1/64 dilüsyonundaki antikor varlığı IFA tekniği ile araştırıldı. Floresans mikroskobu ile değerlendirme deneyimli araştırıcılar tarafından yapıldı ve ≥ 2+ yansıma alınması pozitif reaksiyon olarak kabul edildi.

Verilerin istatistiksel analizi için SPSS Ver 16.0.0 programı kullanıldı. Yöntemler arasındaki uyum Cohen k (kappa) ve Landis-Koch değerlendirmesi dikkate alınarak belirlendi19,20.

BULGULAR

Araştırmaya alınan serum örneklerinden elde edilen veriler Tablo I'de gösterilmektedir. Test edilen iki hücre grubu arasındaki rastlantısal olmayan uyum (Cohen k değeri) 0.68 olarak bulunmuş ve "güçlü tutarlı" olarak değerlendirilmiştir. Bu sonuç Landis-Koch değerlendirmesine göre, "iki test arasında önemli derecede uyuşma bulunmaktadır" şeklinde yorumlanmıştır. Vero hücrelerinde eş zamanlı üremenin daha çok olduğu, buna bağlı değerlendirmenin daha kolay olduğu gözlenmiştir.


Tablo I

TARTIŞMA

Bartonellozun tanısında lenf nodu veya diğer enfekte dokulardan alınan biyopsi örneklerinin PCR ile analizi tanı koydurucudur. Ancak invazif işlem gerektirmeyen serolojik testler, tanıda ilk basamağı oluşturmaktadır6,13,21. Ulaşılabilen literatürdeki B.henselae seroprevalansı araştırmalarında, antijen kaplı lamların hazırlanmasında B.henselae'nın çoğunlukla Vero hücrelerinde, ikinci sırada da Hep-2 hücrelerinde eş-kültür yöntemi ile çoğaltıldığı görülmekle birlikte, besiyerinde üretilen bakterilerden elde edilen antijenlerin kullanıldığı çalışmalar da bulunmaktadır6,7,8,9,10,14,22,23,24.

Laboratuvarda hazırlanan "in-house" kitlerin yanı sıra ticari olarak temin edilen IFA kitleri, toplum taramaları ve hasta örneklerinde tanıya yönelik incelemelerde kullanılmaktadır. Farklı yöntemler ile elde edilen verilerde; çoğunlukla sonuçların değerlendirilmesi ve birbirleriyle karşılaştırılması aşamasında sorunlar ortaya çıkmaktadır. Aynı zamanda testlerin uygulandığı popülasyonun bartonelloz riski veya kesin tanısının bulunmaması da karşılaşılan diğer bir sorundur. Uygun örneğin elde edilebildiği ve moleküler tanımlamaların yapılabildiği uygulamalar dışında, tanısında zorluklar ile karşılaşılan kedi tırmığı hastalığı, bakteriyel peliyoz ve sınırlı lenfadenopati durumlarında, IFA testinin uygulanabildiği hasta popülasyonunda, testin yapıldığı andaki bartonellozun durumu hakkında yeterli bilgi bulunmamaktadır9. Benzer şekilde, bu testlerin yapıldığı ülkelerdeki sınırlı toplumlarda bartonelloz seroprevalansının büyük farklılıklar gösteriyor olması da, kontrol amaçlı negatif popülasyon grubunun oluşturulmasını güçleştirmektedir6,9,13. Bunun nedeni olarak da, farklı bölgelerde bulunabilecek farklı B.henselae genotiplerinin olabileceği ileri sürülmüştür11. Ayrıca test edilen örneklerin farklı Bartonella türleri, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnettii, Rickettsia rickettsii, Ehrlichia chaffeensis, Treponema pallidum, Francisella tularensis ve Mycoplasma pneumoniae ile çapraz reaksiyon verebilmesi de farklı yöntemler ile hazırlanan ortamlarda elde edilen IFA sonuçlarının karşılaştırılmasını zorlaştırmaktadır9,11. Ancak bu çapraz reaksiyonların büyük çoğunluğunun C.burnettii ile olabileceği belirtilmektedir6,13,25. Benzer şekilde Epstein-Barr virus kapsid antijenine karşı gelişen IgM tipi antikorlar da bazı yöntemlerde çapraz reaksiyon verebilmektedir26. B.henselae Marsilya genotipine karşı Toxoplasma gondii IgM tipi antikorları da çapraz reaksiyon oluşturmuştur11. Tsuneoka ve arkadaşları27, hücre kültürlerinde üretilen antijenlerin IgM tipi antikorlara özgül olmayan şekilde bağlanarak yanlış pozitif sonuçlara yol açabildiğini, bu nedenle IgM IFA testlerinde antijenlerin agardan elde edilmesinin, sonuçların yorumlanmasında önemli bir faktör olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bir diğer sorun da, farklı yöntemlerle elde edilen antijenler ile hazırlanan IFA testlerinde, farklı dilüsyonların eşik değer olarak kabul edilmesidir6,9,11,13.

Sunulan araştırmada Cohen k değeri 0.68 bulunmuştur. Bu değerlendirme Cohen tarafından 1960 yılında ortaya atılmıştır, ancak çeşitli araştırıcılar tarafından farklı yorumlanmaktadır28,29. Literatürde farklı iki testin uyumu için önerilen diğer bir değerlendirme metodu Landis ve Koch20 tarafından ileri sürülmüştür; ancak bu değerlendirmenin de her zaman uyumu belirtemediği vurgulanmaktadır. Yine de her iki test için 0.60'ın üzerinde saptanan değer, genellikle testlerin uyumlu olduğu yönündedir. İstatistiksel verinin (Cohen k) elde edilmesinde test edilemeyen en önemli parametre, IFA değerlendirmesi yapanların "grup içi uyumu"dur. Bu durum araştırıcıların deneyimi ile değişkenlik gösterecektir. Bu nedenle sunulan araştırmada, farklı çalışmalar nedeniyle daha önce aynı test yöntemini kullanmış deneyim sahibi araştırıcılar IFA testi değerlendirmesine katılmışlardır.

Çalışmamızda elde edilen veriler, laboratuvar ortamında hazırlanan HeLa hücrelerinde eş-kültüre alınan B.henselae'dan elde edilen antijenlerin, bartonelloz tanısında IFA yönteminde kullanılabileceğini düşündürmektedir. Burada kısıtlayıcı basamak, elde edilecek olan verilerin literatürde yer alan Vero ve Hep-2 hücre temelli veya agarda üretilen antijenlerle yapılan araştırmaların verileri ile karşılaştırılmasındaki zorluklardır. HeLa hücrelerinde çoğaltılan antijenin IFA testinde kullanımında güvenilirliğine ait veriler yukarıda tartışılan parametreler açısından farklı araştırmalar ve araştırıcılar tarafından değerlendirilmelidir. Ülkemizde insanlarda ve hayvanlarda bartonelloz seroprevalansına yönelik taramalar henüz yeni başlamıştır18,30. Bu taramalarda en önemli sorunlardan biri maliyettir. Vero hücre serileri ile aralarında büyük maliyet farkı olmamakla birlikte, özellikle ortak amaca yönelik genetik, biyoloji ve mikrobiyoloji alanlarına sahip araştırma laboratuvarlarında, HeLa hücrelerinin B.henselae ile eş-kültürünün yapılması maliyetin düşürülmesi konusunda yardımcı olabilir. Benzer şekilde farklı genotiplere sahip Bartonella suşlarının hücre dizilerinde antijen özelliklerinin araştırılmasında, maliyeti düşük, özgüllüğü ve duyarlılığı yüksek testlerin oluşturulması gereklidir.

KAYNAKLAR

  1. Chomel BB, Boulouis HJ, Maruyama S, Breitschwerdt EB. Bartonella spp. in pets and effect on human health. Emerg Infect Dis 2006; 12(3): 389-94. [Özet]
  2. Boulouis HJ, Chang CC, Henn JB, Kasten RW, Chomel BB. Factors associated with the rapid emergence of zoonotic Bartonella infections. Vet Res 2005; 36(3): 383-410. [Özet]
  3. Anderson BE, Neuman MA. Bartonella spp. as emerging human pathogens. Clin Microbiol Rev 1997; 10(2): 203-19. [Özet] [PDF]
  4. Carithers HA. Cat scratch disease: an overview based on a study of 1200 patients. Am J Dis Child 1985; 139(11): 1124-33. [Özet]
  5. Florin TA, Zaoutis TE, Zaoutis LB. Beyond cat scratch disease: widening spectrum of Bartonella henselae infection. Pediatrics 2008; 121(5): e1413-25. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  6. Sander A, Berner R, Ruess M. Serodiagnosis of cat scratch disease: response to Bartonella henselae in children and a review of diagnostic methods. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2001; 20(6): 392-401. [Özet]
  7. Sander A, Posselt M, Oberle K, Bredt W. Seroprevalence of antibodies to Bartonella henselae in patients with cat scratch disease and healthy controls: evaluation and comparison of two commercial serological tests. Clin Diagn Lab Immunol 1998; 5(4): 486-90. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  8. Zbinden R, Michael N, Sekulovski M, von Graevenitz A, Nadal D. Evaluation of commercial slides for detection of immunoglobulin G against Bartonella henselae by indirect immunofluorescence. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1997; 16(9): 648-52. [Özet]
  9. Maurin M, Rolain JM, Raoult D. Comparison of in-house and commercial slides for detection by immunofluorescence of immunoglobulins G and M against Bartonella henselae and Bartonella quintana. Clin Diagn Lab Immunol 2002; 9(5): 1004-9. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  10. Tsuneoka H, Fujii R, Fujisawa K, et al. Clinical evaluation of commercial serological test for Bartonella infection. Kansenshogaku Zasshi 2000; 74(4): 387-91. [Özet]
  11. Vermeulen MJ, Verbakel H, Notermans DW, Reimerink JH, Peeters MF. Evaluation of sensitivity, specificity and cross-reactivity in Bartonella henselae serology. J Med Microbiol 2010; 59(Pt 6): 743-5. [Tam Metin] [PDF]
  12. Bergmans AM, Peeters MF, Schellekens JF, et al. Pitfalls and fallacies of cat scratch disease serology: evaluation of Bartonella henselae-based indirect fluorescence assay and enzyme-linked immunoassay. J Clin Microbiol 1997; 35(8): 1931-7. [Özet] [PDF]
  13. Vermeulen MJ, Herremans M, Verbakel H, et al. Serological testing for Bartonella henselae infections in the Netherlands: clinical evaluation of immunofluorescence assay and ELISA. Clin Microbiol Infect 2007; 13(6): 627-34. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  14. Zbinden R, Höchli M, Nadal D. Intracellular location of Bartonella henselae cocultivated with Vero cells and used for an indirect fluorescent-antibody test. Clin Diagn Lab Immunol 1995; 2(6): 693-5. [Özet] [PDF]
  15. Riess T, Andersson SG, Lupas A, et al. Bartonella adhesin a mediates a proangiogenic host cell response. J Exp Med 2004; 200(10): 1267-78. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  16. Kempf VA, Volkmann B, Schaller M, et al. Evidence of a leading role for VEGF in Bartonella henselae-induced endothelial cell proliferations. Cell Microbiol 2001; 3(9): 623-32. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  17. Regnery RL, Olson JG, Perkins BA, Bibb W. Serological response to "Rochalimaea henselae'' antigen in suspected cat-scratch disease. Lancet 1992; 339(8807): 1443-5. [Özet]
  18. Yılmaz C, Ergin Ç, Kaleli İ. Pamukkale Üniversitesi Kan Merkezi'ne başvuran donörlerde Bartonella henselae seroprevalansının araştırılması ve risk faktörlerinin irdelenmesi. Mikrobiyol Bul 2009; 43(3): 391-401. [Özet]
  19. Hayran M, Özdemir O. Bilgisayar, İstatistik ve Tıp. 1996. Hekimler Yayın Birliği, Ankara.
  20. Landis JR, Koch GG. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics 1977; 33(1): 159-74. [Özet]
  21. Herremans M, Vermeulen MJ, Van de Kassteele J, Bakker J, Schellekens JF, Koopmans MP. The use of Bartonella henselae-specific age dependent IgG and IgM in diagnostic models to discriminate diseased from non-diseased in cat scratch disease serology. J Microbiol Methods 2007; 71(2): 107-13. [Özet]
  22. Al-Majali AM, Al-Qudah KM. Seroprevalence of Bartonella henselae and Bartonella quintana infections in children from Central and Northern Jordan. Saudi Med J 2004; 25(11): 1664-9. [Özet]
  23. Pons I, Sanfeliu I, Cardeñosa N, Nogueras MM, Font B, Segura F. Serological evidence of Bartonella henselae infection in healthy people in Catalonia, Spain. Epidemiol Infect 2008; 136(12): 1712-6. [Özet]
  24. Zbinden R. Bartonella henselae-based indirect fluorescence assays are useful for diagnosis of cat scratch disease. J Clin Microbiol 1998; 36(12): 3741-2. [PDF]
  25. La Scola B, Raoult D. Serological cross-reactions between Bartonella quintana, Bartonella henselae, and Coxiella burnetii. J Clin Microbiol 1996; 34(9): 2270-4. [Özet] [PDF]
  26. Zbinden R, Ströhle A, Nadal D. IgM to Bartonella henselae in cat-scratch disease and during acute Epstein-Barr virus infection. Med Microbiol Immunol 1998; 186(4): 167-70. [Özet]
  27. Tsuneoka H, Fujii R, Yamamoto K, et al. Determination of anti-Bartonella henselae antibody by indirect fluorescence antibody test--comparison of two types of antigen: non-cocultivated B.henselae and cocultivated B.henselae with Vero cells. Kansenshogaku Zasshi 1998; 72(8): 801-7. [Özet]
  28. Sim J, Wright CC. The Kappa statistic in reliability studies: use, interpretation, and sample size requirements. Physic Ther 2005; 85(3): 257-68. [Özet] [Tam Metin] [PDF]
  29. Bakeman R, Gottman JM. The advantages of Cohen's cappa, pp: 62-7. In: Observing Interaction: An Introduction to Sequential Analysis. 1997, 2nd ed. Cambridge University Press, Cambridge, UK.
  30. Çelebi B, Kılıç S, Aydın N, Tarhan G, Carhan A, Babür C. Investigation of Bartonella henselae in cats in Ankara, Turkey. Zoonoses Public Health 2009; 56(4): 169-75. [Özet]

İletişim (Correspondence):

Dr. Çağrı Ergin,

Pamukkale Üniversitesi Tıp Fakültesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

Denizli, Türkiye.

Tel (Phone): +90 258 296 2536,

E-posta (E-mail): cagri@pau.edu.tr

Yazdır