Türkçe       English

<< Geri Yazdır
Doi No: 10.5578/mb.8703

Dermatofitozların Laboratuvar Tanısında Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Kullanılması*

The Use of Polymerase Chain Reaction in Laboratory Diagnosis of Dermatophytosis

Yasin TİRYAKİ1, Berna GÜLTEKİN KORKMAZGİL2, Mete EYİGÖR2, Neriman AYDIN2


1 Aydın Devlet Hastanesi, Mikrobiyoloji Bölümü, Aydın.

1 Aydın State Hospital, Department of Microbiology, Aydin, Turkey.

2 Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Aydın.

2 Adnan Menderes University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Aydin, Turkey.

* Bu çalışma,  Adnan Menderes Üniversitesi Araştırma Fon Saymanlığı tarafından TPF-10010 sayılı proje olarak desteklenmiş ve XXXV. Türk Mikrobiyoloji Kongresi (3-7 Kasım 2011, Kuşadası)'nde sözel bildiri olarak sunulmuştur.

ÖZ

Dermatofitler toplumda sık görülen enfeksiyonlara yol açan mantarlardır. Dermatofitozların tanısında kullanılan klasik yöntemlerden direkt mikroskopik incelemenin tür ayrımını yapamaması, kültürün ise uzun süre gerektirmesi ve duyarlılığının düşük olması gibi dezavantajları bulunmaktadır. Bu çalışmada, klinik örneklerden dermatofitlerin saptanmasında ve kültürden izole edilen suşların tanımlanmasında polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yönteminin performansının araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, dermatofitoz ön tanısı konulan 110 hastaya (69 kadın, 41 erkek; yaş aralığı: 4-82 yıl) ait 63'ü deri ve 60'ı tırnak kazıntısı olmak üzere toplam 123 örnek alınmıştır. Örnekler, rutin direkt mikroskopi ve mantar kültürünün yanı sıra iki turlu (nested) PCR (nPCR) yöntemine dayalı iki ayrı protokol ile incelenmiştir. Birinci protokolde dermatofitlerin kitin sentaz genini (CHS-1) hedefleyen pan-dermatofit nPCR; ikinci protokolde ise Trichophyton rubrum ve T. mentagrophytes'e özgül ITS-1 genlerini hedefleyen primerlerin kullanıldığı nPCR uygulanmıştır. Kültürde üreyen suşlara da aynı şekilde PCR uygulanmıştır. Pan-dermatofit nPCR'da pozitif, T.rubrum/T.mentagrophytes'e özgül nPCR ile negatif sonuç veren örnekler ayrıca dizi analizine alınmıştır. Çalışmamızda, örneklerin 62'sinde (%50) direkt mikroskopik incelemede hif ve/veya spor yapıları görülmüş, 30'unun (%24) kültüründe dermatofit üremiştir. T.rubrum/T.mentagrophytes'e özgül nPCR ile kültürde üreyen izolatların 28'i T.rubrum, ikisi T.mentagrophytes olarak tanımlanmıştır. Direkt uygulamada klinik örneklerin 67'si (%55) pan-dermatofit nPCR ile, 65'i (%53) ise T. rubrum/T. mentagrophytes'e özgül nPCR ile pozitif bulunmuştur. Direkt mikroskopide mantar elemanı görülmeyen örneklerin kültüründe de üreme olmamış, bu örneklerin dokuzu pan-dermatofit nPCR, sekizi T. rubrum/T.mentagrophytes'e özgül nPCR ile pozitif sonuç vermiştir. Kültüründe dermatofit üremesi olan 30 örneğin ikisi, direkt olarak uygulanan pan-dermatofit nPCR ile, biri T.rubrum/T.mentagrophytes'e özgül nPCR ile negatif bulunmuştur. Pan-dermatofit nPCR ile pozitif, T.rubrum/T.mentagrophytes'e özgül nPCR ile negatif sonuç veren üç örnekteki dermatofit suşu dizi analizi ile T.rubrum olarak tanımlanmıştır. Yöntemler arasındaki uyum değerlendirildiğinde; direkt mikroskopi ve kültür arasında orta düzeyde (kappa değeri; κ=0.48), direkt mikroskopi ile pan-dermatofit nPCR ve T.rubrum/T.mentagrophytes'e özgül nPCR arasında iyi düzeyde (κ=0.78), pan-dermatofit nPCR ile T.rubrum/T.mentagrophytes'e özgül nPCR arasında mükemmel düzeyde uyum bulunmuştur (κ=0.93). Çalışmamızda dermatofitozların laboratuvar tanısında kullanılmış olan iki farklı nPCR yöntemi, kültüre göre daha kısa sürede ve yüksek oranda pozitif sonuç vermiştir. Sonuç olarak, dermatofitlerin gerek direkt klinik örneklerden gerekse kültürde üreme sonrası tanımlanmasında nPCR'nin yararlı olduğu düşünülmüştür.

Anahtar sözcükler: Dermatofit; Trichophyton; direkt mikroskopi; kültür; iki turlu PCR.

ABSTRACT

Dermatophytes are among the common causes of fungal infections in the community. Classical diagnostic tests for dermatophytosis have some disadvantages such as failure of direct microscopy in species differentiation and culture methods being time consuming and having low sensitivity. The aim of this study was to investigate the performance of polymerase chain reaction (PCR) in the identification of dermatophytes directly from the clinical samples and the cultures. A total of 123 samples that comprise 63 skin and 60 nail scrapings obtained from 110 patients (69 female, 41 male; age range: 4-82 years) who were prediagnosed as dermatophytosis, were included in the study. Samples were examined with routine direct microscopy, culture and two different nested PCR (nPCR) protocols. The first was a pan-dermatophyte nPCR protocol targeting chitin synthase gene (CHS-1) of dermatophytes and the second was a nPCR protocol which targets specific ITS-1 genes of Trichophyton rubrum and T.mentagrophytes. Similar PCR methods were also applied to cultivated strains. Sequence analysis was performed for the samples that yielded positive results in pan-dermatophyte nPCR and negative results in T.rubrum/T.mentagrophytes - specific nPCR. Hyphae and/or spore structures were observed in 62 (50%) samples with direct microscopic examination and dermatophytes were isolated in 30 (24%) samples. Twenty-eight of the isolates grown in culture were identified as T.rubrum, and two as T.mentagrophytes with T.rubrum/T.mentagrophytes-specific nPCR protocol. In direct application, 67 (55%) of the clinical samples were found positive with pan-dermatophyte nPCR and 65 (53%) were positive with T.rubrum/T.mentagrophytes-specific nPCR. Samples which were negative in direct microscopic examination were also negative in culture. Nine of them were found positive with pan-dermatophyte nPCR and eight were positive with T.rubrum/T.mentagrophytes-specific nPCR. Two of the 30 samples which were positive in culture were negative in direct pan-dermatophyte nPCR, and one of them was negative in T.rubrum/T. mentagrophytes-specific nPCR. Three samples which were positive by pan-dermatophyte nPCR, gave negative result with T.rubrum/T.mentagrophytes-specific nPCR. Sequence analysis was performed for these three samples and all were identified as T.rubrum. In evaluation of concordance between the methods, the agreement of direct microscopy and culture was moderate (kappa value; κ= 0.48), the agreement of direct microscopy and both protocols of nPCR was high (κ= 0.78) and the agreement of both nPCR protocols with each other was excellent (κ= 0.93). Our data indicated that two different nPCR methods used for the laboratory diagnosis of dermatophytosis yielded higher positivity in less time than the culture method. In conclusion, nPCR was considered to be useful in identification of dermatophytosis from either direct clinical samples or culture-isolated strains.

Keywords: Dermatophyte; Trichophyton; direct microscopy; culture; nested PCR.

Geliş Tarihi (Received): 05.11.2014 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 02.12.2014

İletişim (Correspondence):

Doç. Dr. Berna Gültekin Korkmazgil,

Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

Aydın Türkiye

Tel (Phone): +90 256 444 1256/2723,

E-posta (E-mail): gultekinberna@hotmail.com

[ Tam metin ][ PDF ]
<< Geri Yazdır