Türkçe       English

<< Geri Yazdır
Doi No: 10.5578/mb.8889

Candida Türlerini Tanımlayan
Bir Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Geliştirilmesi

Development of a Real-Time Polymerase Chain Reaction Method for the Identification of Candida Species

Harun AĞCA1, Burcu DALYAN CİLO1, Gülşah Ece ÖZMERDİVEN1, Sezcan SAĞLAM1, Beyza ENER1


1 Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Bursa.

1 Uludag University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Bursa, Turkey.

* Bu çalışma, 8. Ulusal Moleküler ve Tanısal Mikrobiyoloji Kongresi (4-7 Haziran 2014, Ankara)'nde poster olarak sunulmuştur.

ÖZ

Candida türleri, nozokomiyal enfeksiyonların önemli bir sebebi olup, kan kültürlerinde en sık izole edilen dördüncü etkendir. Kan kültürlerinden en sık izole edilen türün Candida albicans olmasına karşın, albikans-dışı türlerin görülme sıklığı da giderek artmaktadır. Candida türlerinde antifungal duyarlılık paternleri değişken olabildiğinden albikans-dışı türlerin hızlı tanısı, tedavide kullanılacak antifungal ilaçların belirlenmesi açısından önemlidir. Bu çalışmada, sık rastlanılan Candida türlerini hızlı bir şekilde kan kültürü örneklerinden saptayabilen, tanımlayabilen ve kantitasyon yapabilen bir gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Rt-PCR) testinin geliştirilmesi hedeflenmiştir. Çalışmaya, Haziran-Kasım 2013 döneminde laboratuvarımızda pozitif sonuç alınan 50 ardışık BACTEC (Beckton Dickinson, ABD) şişesi dahil edilmiştir. Kalite kontrolü amacıyla Sabouraud dekstroz agarda üretilen Candida spp. standart suşları (C.albicans ATCC 10231, C.glabrata ATCC 90030, C.tropicalis ATCC 1021, C.krusei ATCC 6258, C.parapsilosis ATCC 22019 ve C.dubliniensis CD36) kullanılmıştır. Ayrıca Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus üreyen BACTEC şişeleri çapraz reaktivitenin araştırılması amacıyla çalışılmıştır. DNA izolasyonu, ticari bir kit (Zymo Research, ABD) ile yapılmış; Candida türlerine ait 18S rRNA bölgesini hedef alan primer ve problar kullanılarak Rt-PCR, LightCycler 480 (Roche, Almanya) cihazında gerçekleştirilmiştir. Reaksiyon karışımı; 20 μl hacimde 2 μl DNA, 2 μl LightCycler Fast Start DNA Master Probe (Roche Diagnostics, Almanya), 2 μl MgCl2 (5 mmol), 2 μl 10x PCR tamponu (Roche Diagnostics, Almanya), 0.5 μl her bir primerden (0.01 nmol/μl) ve 1 μl prob 1 ve 2 (0.1 μmol/μl) (TibMolBiol, Almanya) kullanılarak hazırlanmıştır. Amplifikasyon döngüsü; 95oC'de 10 dk sonrasında 95oC'de 10 sn, 62oC'de 10 sn ve 72oC'de 20 sn'den oluşan 50 döngülük bir program ile uygulanmış; 50 döngü sonrasında erime eğrisi analizi yapılmıştır. Bu amaçla, ürünler önce 50oC'de 30 sn bekletilmiş ve ardından 80oC'ye kadar 0.1oC/sn artışla ısıtılarak eş zamanlı floresans ölçümü yapılmıştır. Kantitasyon için C.albicans ATCC 10231 suşundan hazırlanmış olan 3 x 105 ile 3 x 102 ng/μl arasındaki seri dilüsyon örnekleri kullanılmıştır. Test sonuçlarını karşılaştırmak için, tüm suşlar ayrıca dizi analizi ve geleneksel yöntemlerle de tanımlanmıştır. Çalışmamızda geliştirilen Rt-PCR testi ile tüm standart suşlar ve hasta örneklerinden izole edilen suşlar çoğaltılmış, tanımlanmış ve kantite edilmiştir. Hasta örneklerinin 26'sında C.parapsilosis, 15'inde C.glabrata, 6'sında C.albicans ve 3'ünde C.tropicalis olmak üzere toplam 50 suş saptanmış ve tanımlanmıştır. Elde edilen sonuçların, geleneksel yöntemler ve dizi analizi sonuçları ile tam uyumlu olduğu gösterilmiş ve geliştirdiğimiz testin duyarlılık ve özgüllüğü %100 olarak hesaplanmıştır. Sonuç olarak, sık görülen Candida suşlarını saptamak, tanımlamak ve kantite edebilmek amacıyla geliştirilen Rt-PCR testinin, tekrarlanabiIir, hızlı, güvenilir, duyarlılık ve özgüllüğü yüksek bir test olduğu düşünülmüştür.

Anahtar sözcükler: Candida; tanımlama; gerçek zamanlı PCR; erime eğrisi.

ABSTRACT

Candida species are one of the major causes of nosocomial infections and are the fourth most common agent involved in bloodstream infections. The impact of non-albicans Candida species is increasing, however C.albicans is still the most common species. Since the antifungal susceptibility pattern among Candida spp. may be different, rapid diagnosis and identification of non-albicans Candida spp. are important for the determination of antifungal agents that will be used for treatment. The aim of the study was to describe a real-time polymerase chain reaction (Rt-PCR) assay that rapidly detects, identifies and quantitates Candida species from blood culture samples. A total of 50 consecutive positive blood culture bottles (BACTEC, Beckton Dickinson, USA) identified at our laboratory between June-November 2013, were included in the study. Reference strains of Candida spp. (C.albicans ATCC 10231, C.glabrata ATCC 90030, C.tropicalis ATCC 1021, C.krusei ATCC 6258, C.parapsilosis ATCC 22019 and C. dubliniensis CD36) grown on Sabouraud dextrose agar were used for quality control. BACTEC bottles that were positive for Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus were also studied to search the cross-reactivity. A commercial kit (Zymo Research, USA) was used for DNA extraction. Real-time PCR was performed on LightCycler 480 (Roche, Germany) with primers and probes specific for 18S rRNA of Candida species. Twenty microlitres of the reaction mix contained 2 μl of extracted DNA, 2 μl of LightCycler Fast Start DNA Master Probe (Roche Diagnostics, Germany), 2 μl of MgCl2 (5 mmol), 2 μl of 10x PCR buffer (Roche Diagnostics, Germany), 0.5 μl of each primer (0.01 nmol/μl) and 1 μl of each probe (0.1 μmol/μl) (TibMolBiol, Germany). Amplification was performed using the following conditions; 95oC for 10 mins and 50 cycles of denaturation at 95oC for 10 secs, annealing at 62oC for 10 secs and polymerisation at 72oC for 20 secs. A melting curve was created by cooling the producs at 50oC for 30 secs and then heating to 80oC at a rate of 0.1oC/sec measuring of the fluorescence simultaneously. For the quantitation of fungal DNA according to the standard curve, serial dilutions of C.albicans ATCC 10231 DNA from 3 x 105 to 3 x 102 ng/μl were used. All of the strains were also identified by conventional methods and sequence analysis in order to compare the results obtained by Rt-PCR. In our study, all patient and standard samples could be amplified, identified and quantitated by this developed Rt-PCR method. A total of 50 strains, of them 26 were C.parapsilosis, 15 were C.glabrata, 6 were C.albicans, and 3 were C.tropicalis have been detected and identified among patient samples. The results were completely concordant with the sequencing and conventional methods, so the sensitivity and specificity of this method were estimated as 100 percent. In conclusion, it was novel Rt-PCR developed and evaluated in this study is considered as a rapid, accurate, reproducible, sensitive and specific method for the detection, identification and quantitation of commonly observed Candida spp. strains.

Keywords: Candida; identification; real-time PCR; melting curve.

Geliş Tarihi (Received): 25.08.2014 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 06.01.2015

İletişim (Correspondence):

Yrd. Doç. Dr. Harun Ağca,

Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi,

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

16059 Görükle, Bursa, Türkiye,

Tel (Phone): +90 224 295 4113,

E-posta (E-mail): drharunagca@yahoo.com

[ Tam metin ][ PDF ]
<< Geri Yazdır